Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de Andaime Esofágico Descelularizado
- Obter esôfago suíno intacto em um matadouro de porcos Landrace recém-abatidos que são usados para a produção de alimentos. Um único esôfago fornecerá andaimes suficientes para aproximadamente 30 construtos separados.
nota: Devido ao extenso e demorado protocolo de esterilização necessário, normalmente vale a pena obter e processar um mínimo de 10 esôfagos de uma só vez.
- Coloque imediatamente o esôfago recém-excisado em um pote estéril de 180 mL contendo aproximadamente 150 mL de solução de iodopovidona a 10% por 5 minutos para reduzir qualquer carga microbiana contaminante. Transfira o esôfago para um segundo pote contendo aproximadamente 100 mL de PBS estéril contendo 200 UI / mL de penicilina, 200 μg / mL de estreptomicina e 1,25 μg / mL de anfotericina B.
- Recoloque a tampa do recipiente e transporte o esôfago de volta ao laboratório em temperatura ambiente. Dois ou três esôfagos podem ser transportados em cada recipiente, dependendo do tamanho.
- Uma vez no laboratório, manuseie o tecido em uma capela de fluxo laminar usando técnica asséptica para minimizar a contaminação microbiana. Esterilize pinças, tesouras e lâminas de bisturi embebendo por 5 min em etanol a 70% e enxaguando em PBS estéril.
- Manuseie o esôfago usando uma pinça estéril. Usando a tesoura, corte o esôfago longitudinalmente. Enxágue o tecido colocando o esôfago em um pote estéril de 180 mL contendo aproximadamente 100 mL de PBS estéril e agitando suavemente para remover quaisquer detritos.
- Limpe uma placa de dissecação de cortiça pulverizando generosamente com etanol 70% e deixe secar.
- Remova o esôfago do PBS e, usando agulhas estéreis, prenda o esôfago na placa, com a superfície mucosa para cima. Segure a superfície mucosa em uma extremidade do esôfago com uma pinça estéril e afaste-se da prancha. Isso separará a mucosa da submucosa subjacente.
- Em seguida, use uma lâmina de bisturi estéril para dissecar o esôfago longitudinalmente ao longo da lâmina própria, removendo os pinos à medida que a dissecção progride para permitir que a mucosa seja removida
.
- Reter a mucosa dissecada e descartar a submucosa subjacente.
- Corte e descarte os 2 cm mais proximais e distais da mucosa, pois há um maior número de glândulas submucosas e uma lâmina própria mais espessa nessas áreas, respectivamente.
- Use um bisturi para cortar o tecido restante em 5 cm2. Coloque todo o tecido cortado em um pote estéril de 180 mL contendo aproximadamente 150 mL de PBS estéril e agite suavemente para enxaguar o tecido. Se estiver processando mais de cinco esôfagos ao mesmo tempo, pode ser necessário usar vários potes para esta e as três etapas subsequentes.
- Usando uma pinça estéril, transfira o tecido cortado para um pote de 180 mL contendo 150 mL de NaCl 1 M estéril, 200 UI / mL de penicilina, 200 μg / mL de estreptomicina e 1,25 μg / mL de anfotericina B. Incube por 72 h a 37 ° C.
- Coloque o tecido em um pote fresco de 180 mL contendo 150 mL de PBS estéril. O epitélio terá começado a se separar visivelmente do tecido subjacente. Descasque suavemente o epitélio de descolamento do esôfago do porco usando uma pinça estéril e descarte.
- Coloque o tecido restante em um pote fresco de 180 mL e adicione 150 mL de PBS estéril. Agite suavemente por 5 min para lavar. Despeje o PBS e repita mais duas vezes com PBS novo.
- Coloque todo o tecido em um frasco de vidro de 500 mL contendo 400 mL de solução estéril de glicerol a 80% (v / v) por 24 h em temperatura ambiente. Transfira para 400 mL de solução estéril de glicerol a 90% (v / v) por mais 24 h.
- Armazene em 400 mL de solução estéril de glicerol 100% em temperatura ambiente por um período mínimo de 4 meses para desidratar e esterilizar o tecido, preservando a integridade da membrana basal.
