Extração de exossomos baseada em esferas magnéticas: uma técnica para isolar exossomos específicos de biofluidos

Resumo

Fonte: Tu, M. et al. Detecção de biomarcadores exossômicos por liberação e medição induzida por campo elétrico (EFIRM). J. Vis. Exp. (2015)

Neste vídeo, demonstramos um procedimento para isolar exossomos de biofluidos alvo usando microesferas magnéticas. O procedimento permite a captura rápida de exossomos, que podem ser usados para análise a jusante.

Protocolo

1. Extração de exossomos baseada em esferas magnéticas

1. Pipete uma solução bem misturada de 5 μL de micropartículas magnéticas revestidas com estreptavidina em 495 μL de tampão salino tampão fosfato (PBS) em um tubo de microcentrífuga para ressuspender as contas. Lave e ressuspenda os grânulos com 500 μL de PBS três vezes usando um rack magnético. O rack é uma matriz de ímãs na lateral de uma unidade de alojamento que pode conter os tubos de microcentrífuga de amostra.
   1. Para cada lavagem, primeiro, deixe os tubos descansarem no rack por 1 min e, em seguida, use uma ponta de pipeta para remover cuidadosamente o tampão sobrenadante sem perturbar as contas.
   2. Coloque os tubos em um rack comum sem ímãs na lateral. Adicione 500 μL de PBS nos tubos e use a pipeta para misturar a solução e os grânulos. Em seguida, coloque os tubos de volta no rack magnético para separar novamente as esferas da solução.
   3. Execute esta remoção do tampão por magnetização e ressuspensão em PBS um total de três vezes. Isso executa uma lavagem inicial das partículas magnéticas.
2. Ressuspenda os grânulos em 490 μL de tampão PBS, com o tubo colocado na parte não magnetizada do rack magnético. Pipetar 5 μL de anticorpo anti-CD63 humano de camundongo biotinilado na concentração de estoque de 1,0 mg / mL na mistura de esferas. Use a pipeta para misturar os grânulos e o anticorpo em solução.
3. Coloque os tubos de microcentrífuga com um cordão e uma mistura de anticorpos biotinilados em um rotador de amostras. Defina os parâmetros do rotador para o rotador de amostra para rotação recíproca a 90° inclinando-se por 5 s e vibrando a 5° por 1 s. Gire os tubos de mistura de amostra e grânulo nesses parâmetros por 30 min em RT.
4. Remova o anticorpo não ligado após a conjugação.
   1. Após 30 min de rotação em RT, coloque os tubos de volta no rack magnético por 5 min.
   2. Efectuar três lavagens dos grânulos removendo a fase líquida com uma micropipeta e lavar com 500 μL de PBS. Após a lavagem tripla, ressuspenda os grânulos em 490 μL de caseína-PBS e coloque-os na parte não magnetizada do rack.
5. Extração de exossomos usando esferas revestidas com anticorpos.
   1. Rotule cada tubo com o ID de amostra alvo. Pipete uma amostra de 10 μL de soro ou saliva no tubo de microcentrífuga. Use a pipeta para misturar a amostra e as esferas magnéticas pipetando várias vezes.
   2. Coloque os tubos com amostras e grânulos de anticorpos anti-CD63 humanos no rotador e gire por 2 h em RT. Use os mesmos parâmetros do rotador descritos na etapa 1.3.
   3. Após 2 h de rotação da amostra, execute uma lavagem tripla magnetizando para separar os grânulos da solução, removendo a fase líquida com uma micropipeta e ressuspendendo os grânulos em 500 μL de tampão Tris-HCl. Os grânulos resultantes estão agora ligados aos exossomos e estão prontos para a liberação e medição do campo elétrico.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Anticorpo anti-CD63 humano biotinilado	Ancell, EUA	Telefone: 215-030
Dynabeads MyOne Streptavidin T1	Invitrogen, EUA	Nº 65601
Magnetismo de neodímio (1/10" de diâmetro x 1/32" de espessura)	K&J Magnetics, EUA	DH101
Água destilada ultrapura	Life Technologies, EUA	Rolamento 10977-023
Anti-Fluoresceína-POD, fragmentos Fab	Roche, Alemanha	11426346910
Solução salina tamponada com fosfato	Life Technologies, EUA	10010023
Caseína/PBS	Fisher Scientific, EUA	Rolamento 37532