$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Digestão Tecidual
- Usando uma placa de cultura de tecidos de 100 mm, pique mecanicamente o tecido em pedaços finos ~ 1–2 mm de tamanho usando tesouras de dissecação esterilizadas em autoclave e pinças cirúrgicas (Figura 1B, C). O tecido conjuntivo entre as peças deve ser cortado para garantir a separação adequada e facilitar as próximas etapas.
- Adicione 6 mL da solução de dispase/colagenase ao tecido picado. Em seguida, incube a 37 ° C por aproximadamente 30 min a 1 h.
- Rompa o tecido pipetando com uma pipeta sorológica de 5 mL 15 a 20 vezes.
- Incubar a 37°C por mais 30 min a 1 h.
- Repita as etapas 1.3 e 1.4 mais duas ou três vezes ou até que o tecido se assemelhe a uma pasta e possa passar facilmente pela abertura da pipeta (Figura 1D).
nota: O tamanho inicial da amostra de tecido e a finura da trituração do tecido determinarão quantas vezes é necessário repetir as etapas 1.3 e 1.4. Normalmente, recebemos tecido de aproximadamente 1 cm x 1 cm de tamanho. Além disso, pode-se monitorar a dissociação tecidual usando um microscópio de cultura de tecidos invertido padrão para rastrear o progresso da dissociação celular do tecido. Pequenos aglomerados de células são ideais para o crescimento inicial de células salivares como salispheres.
2. Poços de revestimento com matriz de membrana do embasamento
NOTA: A matriz da membrana basal (BMM) deve ser descongelada durante a noite a 4°C no dia anterior ao uso. Depois de descongelado, o BMM deve ser mantido constantemente no gelo ou a 4 ° C, pois solidificará rapidamente (ou seja, formará um gel) em temperaturas mais quentes. Além disso, deve-se tomar cuidado se as amostras tiverem sido resfriadas no gelo antes do revestimento no BMM, pois as amostras frias "derreterão" o BMM e exporão as células ao prato de plástico.
- Pipete lentamente o BMM (consulte a Tabela de Materiais) em cada poço a ser revestido. Distribua o BMM de maneira uniforme e lenta sobre o poço.
NOTA: Geralmente, usamos 500 μL por cada poço de uma placa de 6 poços, mas esse volume pode ser ajustado para uso em outras variantes de placas, como 12 ou 24 poços, ou conforme desejado para hidrogéis mais espessos ou mais finos.
- Incube as placas revestidas a 37°C por pelo menos 15 min antes do uso para permitir que o BMM solidifique.
3. Filtragem de tecido não digerido, lise de hemácias e revestimento celular
- Transfira o homogeneizado de tecido da etapa 1.5 para um tubo cônico de 15 mL. Lave a placa uma vez com 6 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) para transferir as células restantes.
- Filtre o homogeneizado em um tubo cônico de 50 mL através de um filtro de células de malha de náilon de 70 μm para remover o tecido não digerido. Centrifugue as células filtradas por 5 min a 500 x g.
- Dilua o tampão de lise de 10x RBC em dH2O estéril para fazer uma solução de trabalho 1x.
- Aspire o sobrenadante. Em seguida, ressuspenda o pellet celular em 10 mL de tampão de lise de 1x eritrócitos. Incube por 5 min a 37°C.
- Adicione 20-25 mL de DPBS para neutralizar o tampão de lise de hemácias e minimizar a lise das células salivares. Centrifugue por 5 min a 500 x g.
nota: Após o tratamento com tampão de lise de hemácias, o pellet celular deve ser branco. A cor vermelha no pellet indica que nem todas as hemácias foram totalmente lisadas. Repita as etapas 3.4 a 3.5, se necessário, para a lise completa de todos os eritrócitos.
- Aspire o sobrenadante. Ressuspenda o pellet em 1–2 mL de BEGM por poço e, em seguida, coloque as células ressuspensas em poços revestidos com BMM. Incubar a 37°C.
- Uma vez plaqueadas no BMM, as células se formarão em estruturas esféricas ou "salispheres" durante um período de 2 a 3 dias. As células podem ser mantidas como salispheres por cerca de 5 a 7 dias antes que o BMM comece a se degradar, permitindo que as células acessem e adiram ao plástico e cresçam como uma monocamada.