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1. Preparação de Sondas de Nanopartículas
NOTA: Este ensaio utiliza Nanobastões de Ouro Funcionalizados (AuNRs; 25 nm de diâmetro x 71 nm de comprimento) que são covalentemente conjugados com polímeros de neutravidina (AV) e têm um pico de ressonância plasmônica de superfície que produz um sinal de espalhamento vermelho (pico de 641 nm) após a iluminação DFM.
- Lave 40 μL de AuNR-AV (2,56 x 1011 partículas) três vezes com 200 μL de PBS (pH 7,0) por centrifugação e aspiração (8.500 x g a 4 ° C por 10 minutos), seguido por uma etapa final de centrifugação e aspiração após a qual o pellet AuNR-AV é suspenso em 40 μL de PBS.
- Misturar esta suspensão AuNR-AV com 10 μL de anticorpo biotinilado (0,5 mg/ml) específico para um antigénio na superfície do subtipo de exossoma de interesse e 150 μL de PBS e, em seguida, misturar a 4 °C durante 2 h utilizando um misturador para permitir que a ligação neutravidina-biotina atinja a conclusão.
- Lave os AuNRs conjugados com anticorpos resultantes (AuNR-IgG) três vezes por centrifugação e aspiração (6.500 x g a 4 ° C por 10 minutos) e, em seguida, suspenda-os em 200 μL de PBS e armazene-os a 4 ° C até o uso.
nota: Técnica estéril e tempos de armazenamento curtos devem ser usados para evitar contaminação e degradação do AuNR-IgG. É melhor usar AuNRs conjugados com anticorpos dentro de 24 horas após sua conjugação.
2. Preparação de slides de captura EV
- Dilua os anticorpos de captura de exossomas selecionados a 0,025 mg/ml em PBS e adicione 1 μL/poço desta diluição numa lâmina de proteína A/G de vários poços e, em seguida, incube esta lâmina a 37 °C durante 1 h numa câmara humidificada para permitir a ligação do anticorpo de captura à proteína A/G imobilizada na lâmina.
- Aspirar poços para remover anticorpos não ligados e lavá-los três vezes pela adição e aspiração de 1 μL/poço de PBS. Em seguida, carregue cada poço com 1 μL de tampão de bloqueio (consulte a Tabela de Materiais) e incube a lâmina por 2 h a 37 ° C em uma câmara umidificada para bloquear quaisquer locais de ligação de proteínas restantes.
- Aspire os poços para remover o tampão de bloqueio, lave os poços três vezes pela adição e aspiração de 1 μL / poço de PBS e use imediatamente as lâminas bloqueadas para captura e análise de exossomos.
3. Preparação da Curva Padrão
- Para quantificar com precisão a abundância absoluta ou relativa de um subtipo específico de exossomo, o usuário deve gerar uma curva padrão com uma população de exossomos pura que expresse uniformemente o biomarcador de superfície do exossomo de interesse. Este estudo analisa a abundância de exossomos que expressam uma proteína de membrana associada à metástase, o receptor Ephrin A2, que tem uma relação relatada com o estágio e prognóstico do câncer de pâncreas.
nota: A linhagem celular de câncer pancreático humano PANC-1 e seus exossomos são conhecidos por expressar essa proteína e exossomos isolados dessa linhagem celular foram usados para gerar uma curva padrão para quantificar o número de exossomos que expressam essa proteína em amostras complexas de exossomos.
- Cultivar células durante 48 horas a 37 °C em meios de cultura isentos de soro, a fim de permitir a acumulação de exossomas no meio, isolar os sobrenadantes da cultura celular por centrifugação de culturas em suspensão ou aspiração directa de meios de cultura de culturas de células aderentes.
- Centrifugar o meio recolhido a 2000 x g durante 30 min para remover os detritos e recuperar o sobrenadante.
- Filtre o sobrenadante de cultura clarificado através de uma unidade de filtro de baixa ligação a proteínas de 0,45 μm de capacidade apropriada (por exemplo, uma unidade de filtração a vácuo de poliéter sulfona de 250 mL).
- Concentrar o filtrado resultante por centrifugação a 3200 x g, utilizando um sistema de filtro com limite de peso molecular nominal de 100 000 μl, até um volume final de 250 μl. Recolha o volume retido deste filtro, lave o filtro com 200 μL de PBS e combine este volume de lavagem com o volume de amostra de exossoma recolhido.
- Centrifugar esta amostra a 21.000 x g durante 45 minutos e recuperar cuidadosamente o sobrenadante, tendo o cuidado de não recolher qualquer material precipitado.
- Centrifugar o sobrenadante recuperado a 100.000 x g durante 3 horas para precipitar os exossomas. Aspirar o sobrenadante e recolher o sedimento de exossoma em 100 μL de PBS.
- Armazene as suspensões de exossomos resultantes a 4 °C se usadas dentro de 24 horas ou a -80 °C para armazenamento de longo prazo.
NOTA: Não sujeite amostras de exossomos a ciclos repetidos de congelamento e descongelamento.
- Quantificar uma alíquota da suspensão de exossomos após mistura por medição direta do número de exossomos (por exemplo, por análise de rastreamento de nanopartículas ou detecção de pulso resistivo sintonizável ou medição da concentração de proteínas de lisados de exossomos por ensaio de ácido microbicinchonínico, ou um método equivalente, como um meio de aproximar a quantidade de exossomos).
- Gere um conjunto de diluições seriais da suspensão de exossomos para permitir a comparação do sinal de nanopartículas com o número de exossomos de entrada ou conteúdo de proteína.
- Transfira 1 μL de cada padrão de exossomo para cada um de seus poços replicados na placa de ensaio.
NOTA: As curvas padrão podem ser usadas para calcular a inclinação da linha de correlação entre o sinal da nanopartícula e a concentração do exossomo para (1) avaliar o desempenho do ensaio e (2) determinar a concentração relativa dos exossomos alvo em amostras experimentais.
4. Processamento de amostras de plasma ou soro humano
- Colher amostras de plasma ou soro por métodos normalizados e conservá-las a -80 °C até serem necessárias para a análise dos exossomas. Descongele rapidamente as amostras em banho-maria em temperatura ambiente. Misture repetidamente as amostras descongeladas por inversão para promover suspensão homogênea.
NOTA: Os resultados das amostras de soro e plasma podem não ser equivalentes, pois há uma liberação significativa de exossomos durante a reação de coagulação.
- Centrifugue amostras de plasma ou soro a 500 x g por 15 min para precipitar agregados de proteínas e outros detritos. Transferir uma alíquota da amostra de plasma ou soro para um novo tubo e adicionar PBS para obter uma diluição de 1:1. Misturar a amostra diluída por vórtice suave ou inversão, conforme apropriado. Transferir 1 μL de cada suspensão de plasma ou soro para cada um dos seus alvéolos replicados na placa de ensaio.
5. Captura e Detecção de Exossomos
- Carregue os poços de uma lâmina de captura EV bloqueada com 1 μL/poço de amostra de exossomo, usando 8 réplicas por amostra, e incube a lâmina durante a noite a 4 °C em uma câmara umidificada. Aspire todos os poços de amostra e, em seguida, adicione 1 μL / poço de PBS para lavar os poços e remover exossomos não ligados e outros contaminantes da amostra de exossomo carregada.
- Carregar os alvéolos de recolha de amostras com 1 μl/alvéolo de uma suspensão AuNR-IgG previamente preparada (ver secção 1 acima) e incubar a lâmina durante 2 h a 37 °C numa câmara humidificada. Aspire a solução de nanopartículas e lave a lâmina em PBS suplementada com 0,01% de Tween-20 (PBST) por 10 min usando um misturador, depois aspire e lave todos os poços de amostra com água deionizada por 10 min usando um misturador rotativo e seque ao ar para imagens LMDFM subsequentes.
NOTA: Os coeficientes de variação (CVs) entre ensaios são avaliados a partir de oito réplicas da mesma amostra. As amostras que apresentam CVs >20% são consideradas não informativas e devem ser repetidas, se houver amostra suficiente.