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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de CTCs
- Calcule o número de CTCs necessárias para injeção e prepare uma suspensão de célula única a 1,0 × 104 células/μL em solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS). Colocar a suspensão celular no gelo ou a 4 °C durante todo o procedimento.
nota: Ao usar linhagens celulares que requerem tripsinização, certifique-se de lavar as células duas vezes com PBS estéril para remover a tripsina. Realize a contagem de células usando um hemocitômetro ou um contador de células automatizado. Se uma grande coorte (>50 camundongos) for usada, reconte as células e valide a viabilidade celular entre as injeções para garantir que um número consistente de células seja administrado por camundongo.
2. Procedimento pré-cirúrgico
- Injete no camundongo por via subcutânea 5 mg / kg de buprenorfina de liberação sustentada (Bup-SR).
nota: Não injete a área da incisão proposta; Escolha um local de injeção bem longe da escápula.
- Anestesie o camundongo com isoflurano a 2–3% até que ele não mostre sinais do reflexo de endireitamento. Além disso, verifique o reflexo de pinça da cauda e/ou da pata para confirmar o estado da anestesia.
- Prepare o mouse para a cirurgia em um local distante da área de operação. Prenda o local da cirurgia (ou seja, a superfície dorsal do crânio) com área de borda suficiente para evitar que o pelo contamine o local da incisão; Em seguida, sature o local com anti-séptico germicida da pele, trabalhando do centro do local para a periferia, e deixe secar. Aplique um campo estéril ou um material de campo plástico estéril com adesivo para proteger o local da cirurgia contra contaminação.
nota: Os instrumentos devem ser autoclavados com antecedência e as pontas reesterilizadas entre os animais usando um esterilizador de esferas de vidro.
- Raspe o pelo de toda a superfície ventral da cabeça e prepare a pele usando a técnica estéril.
- Posicione o nariz com um cone nasal em forma de L modificado do aparelho estereotáxico, garantindo que as narinas permaneçam claras e abertas. Usando fita adesiva nas superfícies ventrais de ambos os pavilhões auriculares, puxe suavemente a pele para frente para prendê-la ao cone do nariz e dobre o pescoço em um ângulo de aproximadamente 90° depois de preso. Administrar isoflurano a 1,5% para manter a anestesia.
nota: O posicionamento adequado resultará na apresentação da área da incisão de maneira a permitir a fácil identificação da crista caudal do osso occipital.
- Posicione o corpo para garantir que a coluna seja mantida nivelada com a cisterna magna e, ao aplicar uma leve tração na cauda, coloque fita adesiva na base da cauda para prender.
3. Injeção Cirúrgica de Cisterna Magna
- Com o pescoço em extensão total e começando logo entre as pinas, passe as pontas da tesoura cirúrgica para baixo com uma leve pressão sobre o osso occipital.
nota: Enquanto nesta posição da linha média, uma pequena depressão é perceptível quando as pontas da tesoura mergulham na área côncava sobre a cisterna magna.
- Faça uma pequena incisão na linha média de 3 a 5 mm logo acima da concavidade palpada. Aspire 5 μL de suspensão celular a 1,0 × 104 células/μL (total de 5,0 × 104 células) em uma seringa Hamilton de 30 G.
- Use uma pinça de ponta romba com pontas de 1–2 mm para pressionar suavemente a cisterna magna. Introduza as pontas na posição fechada e abra-as enquanto aplica pressão para baixo na dura-máter.
- Repita a dissecção romba descrita na etapa anterior até que a membrana dural seja facilmente identificada e os vasos sanguíneos associados sejam visíveis na área exposta.
nota: A janela de injeção resultante garante que os vasos sanguíneos não sejam danificados durante a inserção da agulha.
- Enquanto mantém a pinça aberta para retrair a musculatura circundante, introduza uma agulha sem núcleo de 30 G sob a dura-máter para visualizar o chanfro. Certifique-se de que a agulha seja introduzida apenas um pouco além do próprio chanfro. Implante lentamente um êmbolo de seringa e libere as células logo abaixo da dura-máter.
- Coloque corretamente o chanfro para observar a injeção sob a dura-máter. Administre cuidadosamente a técnica e use a agulha sem perfuração de 30 G para evitar danos à membrana e garantir vazamento mínimo. Se for observado vazamento, aplique uma leve pressão com um aplicador com ponta de algodão.
- Feche a pele aplicando um clipe de ferida ou uma micro-gota de adesivo cutâneo. Uma vez que a injeção seja realizada com sucesso, permita que os camundongos se recuperem da anestesia em um cobertor quente, observando-os continuamente até que possam manter a posição esternal e demonstrar movimentos intencionais.
- Monitore os camundongos diariamente após a cirurgia durante a primeira semana. Se um camundongo parecer estar com dor ou angústia, trate-o com injeção subcutânea de carprofeno de 10 mg / kg uma vez a cada 12 a 24 horas por até 5 dias com base na consulta veterinária e na diretiva. Permita que os camundongos se recuperem e monitore-os por pelo menos 48 a 72 h antes de prosseguir para a próxima etapa.
nota: Bup-SR, administrado preventivamente, durará até 72 h, portanto, analgésicos adicionais normalmente não são necessários. No entanto, os animais receberão analgésicos adicionais conforme necessário (se letárgicos, não comerem, irritados). Se um local cirúrgico desenvolver sinais de infecção pós-operatória (ou seja, vermelhidão, inchaço, sensibilidade, alodinia, hiperalgesia, hiperpatia ou supuração), ou se o camundongo estiver protegendo a área afetada, eutanasiar o camundongo. Se as células cancerígenas forem injetadas com sucesso no LCR, a LMD e a progressão do tumor se desenvolverão no SNC dentro de 1 ou 2 semanas (dependendo dos tipos de CTCs ou linhagem celular usada) (Figura 1).
