Injeção intracerebroventricular em camundongo: um método de administração direta de medicamentos mediado por Ommaya para administrar medicamentos aos ventrículos cerebrais do cérebro de camundongos

Resumo

Fonte: Law, V. et al. Um modelo de xenoenxerto Murine Ommaya para estudar a terapia direcionada direta da doença leptomeníngea. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra a injeção intracerebroventricular mediada por ommaya em um modelo de camundongo. O método permite a entrega localizada de potenciais candidatos a medicamentos e evita a barreira hematoencefálica.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Montagem e Implantação do Ommaya Murino

1. Preparação da estação
   1. Desinfete a superfície da estação. Coloque uma cobertura azul sobre a superfície e mantenha prontas todas as ferramentas e suprimentos esterilizados indicados na Figura 1.
2. Procedimento pré-cirúrgico
   1. Aplique analgesia (Bup-SR) e mantenha o ambiente cirúrgico estéril.
3. Implante cirúrgico de Ommaya Murina
   1. Monte o dispositivo de injeção Murine Ommaya usando uma porta de injeção em miniatura de 25G (0.51 mm de diâmetro externo) e um disco espaçador de 1 mm. Use um adesivo estéril de cianoacrilato para garantir a penetração de aproximadamente 2.5 mm da cânula de metal no hemisfério cerebral direito (Figura 2A–C).
      nota: Um protótipo Mouse Ommaya compatível com ressonância magnética foi desenvolvido neste laboratório, que já possui ambas as partes (porta de injeção em miniatura e espaçador) impressas em 3D juntas como uma única unidade (Figura 2D). A versão de unidade única foi testada por ressonância magnética e pode economizar tempo eliminando a etapa de montagem.
   2. Anestesiar o camundongo com isoflurano a 2–3% até que não haja sinais do reflexo de endireitamento. Além disso, verifique o reflexo de pinça da cauda e/ou da pata para confirmar o estado da anestesia.
   3. Raspe toda a superfície ventral da cabeça do pelo e prepare a pele de acordo com a técnica estéril. Colocar o camundongo no aparelho estereotáxico com um cone nasal para continuar a administração de isoflurano durante o procedimento; diminuir o isoflurano para 1,5%. Aperte suavemente as barras auriculares para prender a cabeça e aplique lubrificante ocular para cobrir os olhos do mouse.
   4. Faça uma pequena incisão na pele (3 mm), seguida de dissecção romba dos tecidos subcutâneos subjacentes para expor o crânio. Seque o crânio usando bastões aplicadores com ponta de algodão embebidos em peróxido de hidrogênio.
   5. Faça um orifício de rebarba no crânio 0,5 mm posterior e 1,1 mm lateral do bregma - o ponto anatômico no crânio onde a sutura coronal é interceptada perpendicularmente pela sutura sagital (Figura 2A), bem como um orifício de rebarba de 0,9 mm para expor a dura-máter. Mova a microbroca para o lado e marque suavemente o osso imediatamente ao redor do orifício da rebarba antes de inserir uma porta de injeção (profundidade de aproximadamente 2.5 mm), afixada ao crânio usando um adesivo estéril de cianoacrilato. Indique a sutura ao redor do local da injeção usando suturas de náilon 4-0 sem absorção em um padrão de ponto interrompido ou sutura de cordão de bolsa.
   6. Camundongos pós-cirúrgicos domésticos em gaiolas individuais para recuperação cirúrgica.
      nota: É possível que o Murine Ommaya possa sair quando vários camundongos recuperados da cirurgia são alojados na mesma gaiola, possivelmente devido a constantes interações de adulteração. Recomenda-se que os camundongos implantados com Murine Ommaya sejam alojados individualmente (ou não mais do que 2 camundongos por gaiola) ao longo do estudo de eficácia do medicamento.

2. Tratamento Murine Ommaya

1. Dosagem de camundongos usando o Murine Ommaya
   1. Anestesiar o camundongo com isoflurano a 2–3%, até que não haja sinais de reflexo de endireitamento. Além disso, verifique o reflexo de pinça da cauda e/ou da pata para confirmar a manutenção da anestesia.
   2. Acesse o Murine Ommaya usando um adaptador de injeção de porta e uma seringa Hamilton. Usando uma pinça, segure a parte superior da porta de injeção em miniatura e insira cuidadosamente o adaptador do injetor de porta totalmente no septo da porta.
      nota: O injetor de porta perfura o septo da porta de uma maneira que reduz o espaço morto ao mínimo e permite a injeção controlada por meio de uma bomba de seringa motorizada (Figura 3A). Tratamentos direcionados/novos são injetados a uma taxa de fluxo de 1 μL/min durante a anestesia. O tratamento deve ser administrado em intervalos especificados (diário/semanal) por um período definido (semanas/meses), a critério do pesquisador.
      Um volume entre 3 e 7 μL é ideal, pois um volume <3 μL não é confiável e um volume >7 μL pode causar muita pressão. O tamanho da seringa Hamilton pode variar de 10 a 100 μL, dependendo do número de camundongos em cada braço de tratamento. Pré-carregar o volume apropriado na seringa Hamilton evitará a substituição repetida da seringa, minimizando assim os erros. É melhor dedicar 1 seringa Hamilton por braço de tratamento.
   3. Uma vez feita a injeção, retire o Murine Ommaya do adaptador de injeção da porta usando uma pinça e retorne o camundongo à gaiola para se recuperar da anestesia.

Resultados

Figura 1: Um exemplo de configuração de estação de trabalho para realizar o implante Murine Ommaya em camundongos. (1) Máquina de anestesia a gás/vaporizador. (2) Cortina de papel azul estéril cobrindo um suporte estereotáxico. (3) Dispositivo estereotáxico (suporte/palco, barras auriculares, cone do nariz). (4) Microbroca. (5) Lupa com luz. (6) Bastões aplicadores estéreis com ponta de algodão com recipiente de enxágue salino estéril. (7) Peróxido de h...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Disco espaçador de 1 mm	Alzet, Corporação Durect	#0008670	Apenas disco espaçador
Sutura de nylon de etileno 4-0	Qualquer fornecedor
Bombas de seringa automáticas	Bombas de seringa Harvard (ou qualquer fornecedor)	#70-4505	Bomba 11 Elite
Esterilizador de esferas	Braintree Scientific Inc. (ou qualquer fornecedor)	#GER 5287-120V	Germinador 500
Buprenorfina de Liberação Sustentada (Bup-SR)	Zoopharm		Controlado pela DEA
Adesivo estéril de cianoacrilato	Qualquer fornecedor
Sistema de anestesia por inalação de gás	VeteEquip	#901812	COMPAC5
Seringas de microlitros Hamilton	Hamilton		10, 25, 50 e 100 μL; 30G para injeção de cisterna magna
Peróxido de hidrogénio	Qualquer fornecedor
Sistema de imagem IVIS 200	Caliper Ciências da Vida
Lupa com luz	Qualquer fornecedor
Microbroca	Stoelting (ou qualquer fornecedor)	#51555M
Imagem de ressonância magnética	Bruker	Série BioSpec	opcional
Protótipo Murine Ommaya (compatível com ressonância magnética)	Laboratórios Instech, Inc.	#VAB620-25para ressonância magnética-3,3
Injetor PinPort	Laboratórios Instech, Inc.	#PNP3M-50
Porta de pino	Laboratórios Instech, Inc.	#1-PNP3F28-50
Instrumentos cirúrgicos para roedores (tesouras, pinças)	Roboz Surgical Instrument (ou qualquer fornecedor)
Dispositivo estereotáxico	Stoelting (ou qualquer fornecedor)	#51730M
Papel azul estéril/cobertura de cortina	Qualquer fornecedor
Palitos de algodão estéreis	Qualquer fornecedor