Modelo de células-tronco de glioma marcado com luciferase: um método mediado por lentivírus para preparar células-tronco de glioma marcadas com luciferase para estudos terapêuticos in vitro

Resumo

Fonte: Hu, Z. et al. Um fluxo de trabalho de triagem rápida para identificar uma possível terapia combinada para GBM usando células-tronco de glioma derivadas de pacientes. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra o estabelecimento de células-tronco de glioma marcadas com luciferase por meio da entrega de genes mediada por lentivírus. A luciferase atua como um gene repórter e ajuda a facilitar experimentos rápidos de triagem de drogas.

Protocolo

1. Preparando GSCs marcados com luciferase

1. Comece com a cultura de GSCs e centrifugue a 70 x g por 3 min em temperatura ambiente.
2. Remova o sobrenadante e digere as células com accutase por 4 min a 37 ° C. Use uma ponta de 200 μL e pipete repetidamente para dissociar e ressuspender o pellet celular.
3. Diluir as células para 2 x 10⁵ células por alvéolo numa placa de cultura de 12 poços e cultivar as células durante a noite.
4. Adicionar 30 μL de sobrenadante do vírus luciferase-EGFP (título >10⁸ TU /ml) em cada alvéolo da placa e, em seguida, centrifugar as células a 1.000 x g durante 2 h a 25 °C. Cultivar as células durante a noite.
5. Atualize o meio no dia seguinte e cultive as células por mais 48 h.
6. Observe as células sob um microscópio fluorescente para confirmar a aparência das células GFP-positivas.
7. Use um classificador de células de fluxo para classificar e selecionar os GSCs com alta fluorescência GFP para cultivar ainda mais as células.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
B-27	Gibco	Rolamento 17504-044	50 vezes
FEG	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicilina-estreptomicina	HyClone	SV30010	P: 10.000 unidades/ml S: 10.000 ug/ml
Piruvato de sódio	Gibco	2088876	100 mM