Ensaio baseado em bioluminescência celular: um método de alto rendimento para triagem combinatória de drogas

Abstract

Fonte: Hu, Z. et al. Um fluxo de trabalho de triagem rápida para identificar uma possível terapia combinada para GBM usando células-tronco de glioma derivadas de pacientes.J. Vis. Exp.(2021)

Neste vídeo, descrevemos um método que destaca a utilidade do ensaio de bioluminescência para triagem sensível e rápida de medicamentos. Esses medicamentos podem ser testados sozinhos ou em combinação para avaliar o sinergismo em seu modo de ação.

Protocol

1. Medição da viabilidade celular baseada em bioluminescência

1. Revestir as placas com a mistura de matriz extracelular (ECM) (por exemplo, Matrigel): Adicione 40 μL de mistura de ECM de 0,15 mg / mL a cada poço e incube a placa por 1 h a 37 ° C. Remova o excesso de mistura de ECM e enxágue suavemente uma vez com PBS.
2. Adicionar 100 μL de meio de cultura contendo 15.000, 10.000, 8.000, 6.000, 4.000, 2.000, 1.000 e 500 células XG387-Luc juntamente com 100 μL de meio em branco como controlo em cada alvéolo para 6 repetições numa placa de fundo ótico de 96 poços e cultivar as células durante a noite a 37 °C.
3. Remover o sobrenadante, adicionar 50 μL de meio de cultura contendo 150 ng/μL de D-luciferina em cada alvéolo e incubar as células durante 5 min a 37 °C.
4. Tire imagens da bioluminescência celular na placa usando o sistema de imagem de espectro IVIS. Use o software integrado para criar várias áreas circulares da região de interesse (ROI) e quantificar a bioluminescência celular.

2. Tratamento com Temozolomida e Triagem Combinada

1. Pré-revestir quatro placas de 96 poços conforme descrito acima na etapa 1, antes do tratamento.
2. Semeie células XG387-Luc a uma densidade de 1.000 células em meio de cultura de 100 μL em cada poço de uma placa de fundo óptico de 96 poços e cultive as células durante a noite.
3. Prepare a temozolomida e os agentes direcionados a partir da solução de estoque com antecedência. Preparar uma série de concentrações composta por 800 μM, 600 μM, 400 μM, 300 μM, 200 μM, 100 μM e 50 μM de temozolomida em meio de cultura para o tratamento com agente único. Diluir a temozolomida e os agentes-alvo em solução-mãe no meio de cultura, respectivamente, para obter concentrações finais de 200 μM e 2 μM para triagem de medicamentos combinados (lista de materiais).
4. Remover o meio de cultura quando a maioria dos GSC aderir ao fundo das placas; adicionar o meio acima preparado contendo temozolomida em cada alvéolo para três repetições técnicas por tratamento.
5. Para tratar a temozolomida e rastrear as combinações de medicamentos, remova o meio em branco e adicione o meio preparado acima contendo 200 μM de temozolomida ou 2 μM de agente direcionado, ou uma combinação de ambos em cada poço para três réplicas técnicas por tratamento.
6. Incubar todas as placas a 37 °C, 5% de CO₂ durante 3 dias.
7. Remova o meio contendo o medicamento, adicione 50 μL de meio em branco contendo 150 ng / μL de D-luciferina em cada poço e incube as células por 5 min a 37 ° C.
8. Tire imagens da bioluminescência celular na placa usando o sistema de imagem de espectro IVIS. Use o software integrado para criar vários ROIs circulares e quantificar a bioluminescência celular.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
B-27	Gibco	Rolamento 17504-044	50 vezes
FEG	Gibco	PHG0313	20 ng/ml
FGF	Gibco	PHG0263	20 ng/ml
Gluta Max	Gibco	35050061	100X
Neurobasal	Gibco	21103049	1X
Penicilina-estreptomicina	HyClone	SV30010	P: 10.000 unidades/ml S: 10.000 ug/ml
Piruvato de sódio	Gibco	2088876	100 mM
ABT-737	MCE		Inibidor seletivo e mimético de BH3 Bcl-2 Bcl-xL e Bclw
Adavosertib (MK-1775)	MCE		Inibidor de Wee1
Axitinib	MCE		Inibidor de tirosina quinase multi-alvo
AZD5991	MCE		Inibidor de Mcl-1
UMA 83-01	MCE		Inibidor potente da quinase ALK5 do receptor TGF-β tipo I
CGP57380	Selleck		Inibidor potente de MNK1
Dactolisibe (BEZ235)	Selleck		Inibidor duplo de PI3K e mTOR competitivo de ATP
Dasatinibe	MCE		Inibidor de tirosina quinase da família Bcr-Abl e Src duplo
Erlotinibe	MCE		Inibidor de tirosina quinase EGFR
Gefitinibe	MCE		Inibidor de tirosina quinase EGFR
Linifanibe	MCE		Inibidor multialvo da família VEGFR e PDGFR
Masitinibe	MCE		Inibidor de c-Kit
Ponto ML141	Selleck		Inibidor não competitivo da Cdc42 GTPase
OSI-930	MCE		Inibidor multialvo de Kit, KDR e CSF-1R
Palbociclibe	MCE		Inibidor seletivo de CDK4 e CDK6
SB 202190	MCE		Inibidor seletivo de p38 MAP quinase
Brometo de sepantônio (YM-155)	MCE		Inibidor de survivina
TCS 359	Selleck		Inibidor potente de FLT3
UMI-77	MCE		Inibidor seletivo de Mcl-1
4-Hidroxitamoxifeno (Afimoxifeno)	Selleck		Modulador seletivo do receptor de estrogênio (ER)