Isolamento baseado em SEC de vesículas extracelulares derivadas de microglia: uma técnica para isolar vesículas extracelulares de meios de cultura condicionados por microglia

Abstract

Fonte: Lemaire, Q. et al. Caracterização de Vesículas Extracelulares Derivadas de Células Imunes e Estudo do Impacto Funcional no Ambiente Celular. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo descreve um método baseado em cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para isolar vesículas extracelulares ou EVs derivadas das células imunológicas do cérebro - a microglia. Os EVs atuam como carga molecular para fornecer mediadores, que regulam uma resposta imune. Portanto, os EVs isolados podem ser usados como um modelo in vitro para estudar a interferência microglia-neurônio durante uma resposta imune neuronal.

Protocol

1. Cultura Primária de Microglia/Macrófagos

1. Cultura primária de microglia
   1. Cultura de micróglia primária de rato comercial (2 x 10⁶ células) (ver Tabela de Materiais) em meio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado com 10% de soro livre de exossomos, 100 U/mL de penicilina, 100 μg/mL de estreptomicina e 9,0 g/L de glicose a 37 °C e 5% de CO₂.
   2. Coletar o meio condicionado após uma cultura de 48 h e proceder ao isolamento das VEs.
2. Cultura primária de macrófagos
   1. Cultivar macrófagos primários comerciais de rato (1 x 10⁶ células) no meio fornecido pelo fabricante (ver Tabela de Materiais) a 37 °C e 5% de CO₂, com soro isento de exossomos.
   2. Coletar o meio condicionado após uma cultura de 24 horas e proceder ao isolamento das VEs.

2. Isolamento de EVs

1. Pré-isolamento de EVs do meio condicionado
   1. Transferir o meio de cultura condicionado das culturas de micróglias ou macrófagos (passos 1.1.2 ou 1.2.2) para um tubo cónico.
   2. Centrifugue a 1.200 x g por 10 min em temperatura ambiente (RT) para peletizar as células.
   3. Transfira o sobrenadante para um novo tubo cônico. Centrifugue a 1.200 x g por 20 min em RT para eliminar corpos apoptóticos.
   4. Transfira o sobrenadante para um tubo de policarbonato de 10,4 mL e transfira o tubo para um rotor de 70,1 Ti. Ultracentrífuga a 100.000 x g por 90 min a 4 °C para peletizar os EVs.
   5. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o pellet contendo EVs em 200 μL de tampão fosfato filtrado a 0,20 μm de solução salina (PBS).
2. Isolamento de EVs
   1. Preparação da coluna de cromatografia de exclusão de tamanho caseira (SEC)
      1. Esvaziar uma coluna de cromatografia de vidro (comprimento: 26 cm; diâmetro: 0,6 cm) (ver Tabela de Materiais), lavá-la e esterilizá-la.
      2. Coloque um filtro de 60 μm na parte inferior da coluna.
      3. Empilhe a coluna com uma matriz de base de filtração de gel de agarose reticulada para criar uma fase estacionária de 0,6 cm de diâmetro e 20 cm de altura.
      4. Enxágue a fase com 50 mL de PBS filtrado a 0,20 μm. Conservar a 4 °C para ser utilizado mais tarde, se necessário.
   2. Coloque o pellet EV ressuspenso no topo da fase estacionária da coluna SEC.
   3. Colete 20 frações sequenciais de 250 μL enquanto continua a adicionar PBS filtrado de 0,20 μm no topo da fase estacionária para evitar a secagem da coluna. Armazenar as frações a -20 °C, se necessário.
      nota: Um armazenamento mais longo do que uma semana pode ser realizado a -80 °C para manter a integridade do EV para análise molecular.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Meio de Cultura de Macrófagos e Microglia de Rato	Aplicações de células	R620K-100	Origem celular: Rato saudável normal medula óssea
Microglia primária de rato	Lonza	RG535
Sepharose CL-2B	GE Saúde	17014001
Ultracentrífuga	Beckman Coulter	A95765
rotor de ultracentrífuga 70.1 Ti	Beckman Coulter	342184
glicose	Sigma-Aldrich	G8769
Tampão fosfato salino	Invitrogen	14190094	Sem cálcio, sem magnésio
Tubos de centrífuga em policarbonato	Beckman Coulter	355651
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140-122
Exo-FBS	Ozyme	EXO-FBS-50A-1	FBS esgotado do exossomo
DMEM Gibco 41966029
centrifuga	Eppendorf	5804000010
Incubadora de CO2	ThermoFisher
pluriFiltro M/ 60 μm	pluriSelecione	Rolamento 43-50060
Coluna MonoP FPLC	GE Saúde		Não está mais disponível