Extração baseada em SDS-PAGE de proteínas associadas a vesículas extracelulares: um procedimento para extrair proteínas de EVs e prepará-las para digestão em gel

Resumo

Fonte: Lemaire, Q. et al. Caracterização de Vesículas Extracelulares Derivadas de Células Imunes e Estudo do Impacto Funcional no Ambiente Celular. J. Vis. Exp. (2020)

Neste vídeo, demonstramos o método de digestão em gel SDS-PAGE para extração de proteínas de vesículas extracelulares ou EVs. Uma vez isolados, os fragmentos de proteína obtidos podem ser usados para análise proteômica.

Protocolo

1. Caracterização de EVs

1. Análise de Western Blot
   1. Extração de proteínas
      1. Isole os EVs por coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e quantifique usando análise de rastreamento de nanopartículas (NTA).
      2. Misture 50 μL de tampão RIPA (cloreto de sódio [NaCl] 150 mM, Tris 50 mM, ácido etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'-tetracético [EGTA], ácido etilenodiamina-tetracético [EDTA] 2 mM, fluoreto de sódio [NaF] 100 mM, pirofosfato de sódio 10 mM, Nonidet P-40 1%, fluoreto de fenilmetanossulfonil 1 mM [PMSF], 1x inibidor de protease) com a amostra EV (25 μL resultante da concentração EV no filtro) por 5 min em gelo para extrair proteínas.
      3. Sonicar por 5 s (amplitude: 500 W; frequência: 20 kHz), 3 vezes no gelo.
      4. Remover os detritos vesiculares por centrifugação a 20.000 x g durante 10 min, a 4 °C.
      5. Coletar o sobrenadante e medir a concentração de proteínas com o método de ensaio de proteínas de Bradford.
   2. Eletroforese em gel de dodecil sulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) e western blotting
      1. Misturar extratos proteicos (30 μg) com tampão de amostra Laemmli 5c (v/v).
      2. Carregue a mistura de proteínas em um gel de poliacrilamida a 12%.
      3. Migre as proteínas no gel com tampão TGS (25 mM Tris pH 8,5, 192 mM de glicina e 0,1% SDS), a 70 V por 15 min e 120 V por 45 min.
      4. Transferir as proteínas para uma membrana de nitrocelulose com sistema semi-seco a 230 V durante 30 min.
      5. Saturar a membrana durante 1 h a RT com tampão de bloqueio (0,05% Tween 20 p/v, 5% leite em pó p/v em 0,1 M PBS, pH 7,4).
      6. Incubar a membrana durante a noite a 4 °C com o anticorpo monoclonal de ratinho anti-proteína de choque térmico humano 90 (HSP90) diluído em tampão de bloqueio (1:100).
      7. Lave a membrana três vezes com PBS-Tween (PBS, 0,05% Tween 20 p/v) por 15 min.
      8. Incubar a membrana por 1 h em RT com anticorpo secundário anti-IgG de camundongo conjugado com peroxidase de rábano de cabra diluído em tampão bloqueador (1:10.000).
         NOTA: Um controle negativo é realizado usando apenas anticorpos secundários.
      9. Repita a etapa de lavagem (etapa 1.1.2.7).
      10. Revele a membrana com kit de substrato de western blotting de quimioluminescência aprimorada (ECL) (consulte a Tabela de Materiais).

2. Análise proteômica

1. Extração de proteínas e digestão em gel
   1. Isole os EVs por coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e quantifique usando análise de rastreamento de nanopartículas (NTA). Repita a etapa 1.1.1 para extração de proteína EV.
   2. Realize a migração de proteínas no gel de empilhamento de um gel de poliacrilamida a 12%.
   3. Fixe as proteínas no gel com azul de Coomassie por 20 min em RT.
   4. Extirpar cada pedaço de gel colorido e cortá-lo em pedaços pequenos de 1 mm³.
   5. Lave os pedaços de gel sucessivamente com 300 μL de cada solução: água ultrapura por 15 min, acetonitrila 100% (ACN) por 15 min, bicarbonato de amônio 100 mM (NH₄HCO₃) por 15 min, ACN: 100 mM NH₄HCO₃ (1:1, v/v) por 15 min e ACN 100% por 5 min com agitação contínua.
   6. Seque completamente os pedaços de gel com um concentrador a vácuo.
   7. Realize a redução de proteínas com 100 μL de 100 mM NH₄HCO₃ contendo 10 mM de ditiotreitol por 1 h a 56 ° C.
   8. Realize alquilação de proteínas com 100 μL de 100 mM NH₄HCO₃ contendo 50 mM de iodoacetamida por 45 min no escuro em RT.
   9. Lave os pedaços de gel sucessivamente com 300 μL de cada solução: 100 mM de NH₄HCO₃ por 15 min, ACN: 20 mM NH₄HCO₃ (1:1, v / v) por 15 min e 100% ACN por 5 min com agitação contínua.
   10. Seque completamente as peças de gel com um concentrador a vácuo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Acetonitrilo	Produtos Químicos Fisher	A955-1
Bicarbonato de amónio	Sigma-Aldrich	Rolamento 9830
HSP90 α/β anticorpo (RRID: AB_675659)	Santa-cruz	SC-13119
Concentrado de reagente de corante de ensaio de proteína Bio-Rad (Bradford)	Bio-Rad	5000006
Ditiotreitol	Sigma-Aldrich	Nº 43819
Ácido etilenoglicol-bis(2-aminoetiléter)-N,N,N',N'- tetracético	Sigma-Aldrich	03777-10G
Ácido etilenodiaminotetracético	Sigma-Aldrich	ED-100G
Fisherbrand Q500 Sonicator com Sonda	Marca de pescador	12893543
Idoacetamida	Sigma-Aldrich	I1149
Mancha de proteína InstantBlue Coomassie	Exemplo	ISB1L
Laemmli 2x	Bio-Rad	1610737
Nonidet P-40	Fluka	Rolamento 56741
Peroxidase AffiniPure Goat AntiMouse IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	115-035-003
Conjugado faloidina-tetrametilrodamina	Santa-cruz	SC-362065
Inibidor de Protease	Sigma-Aldrich	S8830-20TAB
cloreto de sódio	Scharlau	SO0227
Dodecil Sulfato de Sódio	Sigma-Aldrich	L3771
Fluoreto de sódio	Sigma-Aldrich	S7920-100G
Pirofosfato de sódio	Sigma-Aldrich	S6422-100G
Concentrador de vácuo SpeedVac	ThermoFisher
Célula de transferência semi-seca Trans-Blot SD	Bio-Rad	1703940