Implantação de janela de imagem craniana em modelo de camundongo: um procedimento cirúrgico para implantar lamínula à base de vidro para acesso óptico estável a regiões do cérebro murino

Resumo

Fonte: Alieva, M. et al. Imagem Intravital Longitudinal do Comportamento de Células Tumorais Cerebrais em Resposta a uma Biópsia Cirúrgica Invasiva.J. Vis. Exp.(2019)

Este vídeo apresenta um procedimento cirúrgico para implantar janela craniana em um modelo de camundongo para acesso óptico estável a diferentes regiões do cérebro.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Implantação de células tumorais e preparação da janela de imagem craniana

1. Preparação cirúrgica
   1. Use camundongos adultos (>6 semanas de idade) de qualquer linhagem ou sexo. Sedar um camundongo injetando fluanisona [neuroléptico] + fentanil [opioide]) (0,4 mL / kg) + sedativo benzodiazepínico (2 mg / kg) na dose de 1: 1: 2 em água estéril. Avalie o estado de sedação do animal por pinça do dedo do pé.
      nota: Neste protocolo, camundongos C57BL/6 fêmeas e machos foram usados devido ao mesmo background genético da linhagem de células tumorais utilizada nesses experimentos (GL261). O mouse permanecerá totalmente sedado por 1,5 h. Como alternativa, use anestesia inalatória, como isoflurano (mistura de isoflurano a 1,5% a 2% / O₂).
   2. Monte o mouse em uma estrutura estereotáxica e prenda a cabeça usando um grampo de nariz e duas barras de ouvido.
   3. Use um aquecimento lamp para preservar a temperatura corporal. O aquecimento lamp deve ser usado com cuidado, alternativamente almofadas de aquecimento de recirculação de água podem ser usadas.
   4. Aplique pomada para os olhos para proteger as córneas do camundongo do ressecamento.
   5. Use uma tesoura afiada para raspar o pelo do crânio (área dorsal dos olhos do rato até a base do crânio) e desinfete a pele exposta com etanol a 70%.
   6. Corte a pele de maneira circular com uma tesoura afiada e raspe o periósteo por baixo com um cotonete. Aplique uma gota de lidocaína 1% + epinefrina 1:100.000 por 5 min e retire o excesso com um cotonete.
   7. Cole as bordas da pele no crânio com cola de cianoacrilato.
   8. Coloque a estrutura estereotáxica sob um microscópio estéreo de dissecção com ampliação de 4x.
   9. Visualize o crânio através do microscópio de dissecção e faça um sulco circular de 5 mm de diâmetro sobre o osso parietal direito. Execute esta etapa com cuidado e apenas superficialmente, evitando qualquer pressão no crânio.
   10. Aplique uma gota de tampão córtex (NaCl 125 mM, KCl 5 mM, glicose 10 mM, tampão HEPES 10 mM, MgSO₄ 2 mM e CaCl₂ 2 mM [pH 7.4]) e levante o retalho ósseo usando uma pinça fina.
   11. Para as etapas a seguir, mantenha a superfície do cérebro coberta com tampão do córtex, salvo indicação em contrário.
   12. Sob o microscópio de dissecação, visualize a superfície do cérebro e remova a dura-máter usando uma pinça curva, cônica e de ponta muito fina. Se ocorrer sangramento nesta fase, use uma esponja de gelatina absorvível para pará-lo.

2. Preparação da janela de imagem craniana

1. Remova o tampão do córtex e coloque uma gota de óleo de silicone no local da craniotomia para evitar bolhas de ar sob a janela.
2. Sele o cérebro exposto com uma lamínula de 6 mm. Aplique cola de cianoacrilato entre a lamínula e o crânio. Pressione suavemente a lamínula contra o crânio com a ajuda de uma pinça fina para garantir uma distância mínima entre o cérebro e a lamínula.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Agulhas hipodérmicas de 25G x 16 mm	BD Microlance
Esponja de gelatina absorvível	Pfizer	Rolamento 300600
Lamínulas redondas 6 mm	VWR internacional		Gelfoam
Cola de cianoacrilato	Pattex	Nº 631-0168	Gel Pattex Ultra
Cimento dentário	Vértice Dental		Autopolimerização de vértices
broca	Dremel		Dremel 3000 (broca dentária pode ser mais conveniente) + 105 Cortador de Gravação
Pinças curvas finas	Dumont
Óleo de silicone	Sigma Aldrich	AGT508
Quadro estereotáxico	Stoelting	181838
Microscópio estereoscópico cirúrgico	Olimpo		Estereotáxico, rato e camundongo padrão de laboratório
Pomada oftálmica	Kela Veterinaria		Duodrops veter kela 10 m
Xilocaína (Lidocaína 1% + Epinefrina 1:100.000) Anestésico local	Astrazeneca		Xilocaína (Lidocaína 1% + Epinefrina 1:100.000)
Hipnotismo	VetaPharma Ltd		Hipnotismo (citrato de fentanil 0,315 mg/mL + fluanison 10 mg/mL)
Midazolam	Actavis		Midazolam Actavis 5 mg/ml