Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Imagem Intravital
NOTA: O intervalo de tempo entre a injeção de células tumorais e a primeira sessão de imagem intravital depende do tipo de linha de células tumorais usada. Para os experimentos mostrados neste protocolo, 1x 105 células GL261 foram injetadas e fotografadas 10 dias depois.
- Preparação de imagem
- Sedar o camundongo usando anestesia inalatória de isoflurano por meio de uma máscara facial (mistura de isoflurano / O2 a 1,5% a 2%).
- Injete no camundongo por via subcutânea 100 μL de tampão salino para evitar a desidratação.
nota: Para imagens de longo prazo, o camundongo pode ser hidratado por meio de uma bomba de infusão subcutânea.
- Coloque o mouse virado para cima em uma caixa de imagem. Use uma placa de metal com um orifício de 1 mm de diâmetro e pequenos ímãs embutidos ao redor da abertura para fornecer fixação do CIW à caixa de imagem. Introduza o isoflurano através de uma máscara facial e ventile por uma tomada do outro lado da caixa (mistura de 0,8% a 1,5% de isoflurano / O2). Opcionalmente, use fita adesiva para fixar o corpo do mouse.
nota: Dextrano marcado com fluorescência para visualização de vasos sanguíneos ou outros corantes podem ser injetados por via intravenosa neste momento.
- Opcionalmente, use um oxímetro de pulso e uma sonda de aquecimento para monitorar os sinais vitais do mous.
nota: Neste experimento, não foi necessário usar um oxímetro de pulso e uma sonda de aquecimento, pois o camundongo estava estável durante todo o período de tempo de imagem (2–3 h). No entanto, para tempos de imagem mais longos, pode ser necessário um monitoramento mais completo.
- Defina a objetiva de água 25x (por exemplo, HCX IRAPO NA0.95 WD 2.5 mm) para a posição z mais baixa e adicione uma gota grande de água.
nota: O uso de um microdispensador de imersão em água é altamente recomendado para experimentos de longo prazo, pois permite que os cientistas adicionem água durante o experimento. Alternativamente, uma objetiva seca pode ser usada.
- Transferir a caixa de imagiologia para o microscópio equipado com uma câmara de clima escuro mantida a 37 °C. Levar a objectiva à lamínula CIW até que a gota de água a toque.
- Usando o modo de epifluorescência, observe o tumor através da ocular e coloque as células em foco.
2. Aquisição de imagem com lapso de tempo
- Selecione várias posições de interesse para criar imagens e registrar suas coordenadas no software. Certifique-se de que as posições selecionadas sejam posições representativas de diferentes locais do tumor (cada tumor pode ser diferente, mas para garantir a consistência, selecione a mesma quantidade de posições que são centrais para o núcleo do tumor e para as bordas em todos os camundongos).
nota: Uma varredura de ladrilhos de uma parte do tumor ou de todo o tumor visível pode ser realizada; no entanto, se o tumor for grande, esse método aumentará o lapso de tempo entre as imagens. Além disso, se as células tumorais se moverem rapidamente, pode ser um desafio rastrear as mesmas células ao longo do tempo.
- Mude para o modo multifotônico e ajuste o laser para o comprimento de onda correto. Observe que, para evitar fotodanos, comprimentos de onda mais altos são desejados.
nota: Para a imagem Dendra2, foi usado um comprimento de onda de 960 nm. Com o objetivo usado nesses experimentos, um zoom de 1,3 foi suficiente para obter uma boa resolução dos núcleos tumorais e escanear uma área representativa do tumor.
- Vá para o modo ao vivo e defina uma pilha z para cada posição, a fim de adquirir o volume máximo de células tumorais sem comprometer a resolução das células tumorais. Defina o tamanho do passo entre as imagens como 3 μm.
- Use o modo bidirecional para aumentar a velocidade de digitalização. A resolução da imagem deve ser de pelo menos 512 x 512 pixels.
- Adquira imagens do volume do tumor em diferentes posições a cada 20 min por 2 h. Adicione água à objetiva antes de cada aquisição de imagem.
nota: As imagens de lapso de tempo podem ser adquiridas automaticamente definindo o lapso de tempo correto no software. No entanto, o mouse pode se mover e a posição ou pilha z pode mudar com o tempo, causando perda de dados. Portanto, é recomendável executar o lapso de tempo manualmente e verificar e ajustar os deslocamentos xyz entre as aquisições.
- Nesta etapa, opcionalmente, fototroque o marcador fluorescente Dendra2.
nota: Ao contrário da imagem de lapso de tempo (que permite estudar as propriedades individuais das células tumorais e como elas mudam ao longo do tempo), isso permitirá estudar a área de infiltração de células tumorais no cérebro por vários dias.
