1. Ensaio de atração de macrófagos in vitro
- Preparação de meios condicionados
- Aquecer o meio de manutenção das células tumorais em banho-maria a 37 °C durante 20 min.
- Pulverize a superfície da coifa de cultura de tecidos com etanol a 70% e limpe o etanol a 70% da superfície com toalhas de papel. Retire a solução de descolamento de células da geladeira. Pulverize os frascos do meio e a solução de descolamento celular com etanol a 70%, limpe o etanol a 70% da superfície com toalhas de papel e leve-os para a capa de cultura de tecidos.
- Retire as placas de 6 poços da incubadora. Pipetar cuidadosamente o meio condicionado para tubos de centrífuga estéreis de 15 ml. Coloque os tubos no gelo. Pipete o meio no "meio apenas" em um tubo de centrífuga estéril separado de 15 mL.
NOTA: Antes desta etapa, certifique-se de verificar ao microscópio se as células se ligam. Caso contrário, pode-se usar placas revestidas para permitir uma melhor fixação ou incluir as células flutuantes na etapa de contagem.
- Adicione 0,5 mL de solução de descolamento de células em cada poço da placa de 6 poços. Verifique se as células tumorais se arredondam a cada minuto. Assim que as células tumorais se arredondarem, bata suavemente na lateral da placa para ajudar as células a se desprenderem.
- Pipete 2,5 mL de meio de manutenção de células tumorais no poço, pipete para cima e para baixo 3 vezes para misturar e transferir as células para um tubo de centrífuga estéril de 15 mL. Pegue 10 μL das células e misture com 10 μL de solução de Trypan Blue. Pipetar 10 μL da mistura para a lâmina de contagem e quantificar o número de células vivas utilizando um contador automático de células.
- Ajustar o volume do meio condicionado de acordo com o número de células utilizando o meio de células estaminais livres de soro (incubação a 37 °C durante a noite). Por exemplo, se o poço A tiver 3x mais células vivas do que o poço com o menor número de células, dilua seu meio condicionado 1:3. Esta etapa é usada para controlar a diferença causada pela taxa de proliferação celular.
nota: A razão para usar meio de células-tronco livres séricas com incubação a 37 ° C durante a noite é controlar a possível mudança no meio com exposição prolongada a 37 ° C.
- Filtre o meio condicionado através de filtros de 0,45 μm. Coloque a mídia condicionada no gelo.
NOTA: Esta etapa remove células e detritos celulares no meio condicionado.
2. Preparação de células MV-4-11
- Aquecer o meio IMDM (sem FBS) em banho-maria a 37 °C durante 20 min.
- Pulverize a superfície da coifa de cultura de tecidos com etanol a 70% e limpe o etanol a 70% da superfície com toalhas de papel. Pulverize o frasco médio com etanol a 70%, limpe o etanol a 70% da superfície com toalhas de papel e leve-os para a capa de cultura de tecidos.
- Leve o frasco de células MV-4-11 para a capa de cultura de tecidos. Pipete 10 mL de células em um tubo de centrífuga estéril de 15 mL. Pegue 10 μL de células e misture com 10 μL de solução de Trypan Blue. Pipetar 10 μL da mistura para a lâmina de contagem e quantificar o número de células vivas utilizando um contador automático de células. Centrifugue as células a 200 x g durante 5 minutos a 4 °C. Aspirar o sobrenadante.
- Lave as células com 10 ml de PBS e centrifugue as células a 200 x g durante 5 min a 4 °C. Aspirar o sobrenadante.
- Ressuspenda as células em meio IMDM (sem FBS) para uma densidade celular final de 1x106 células/mL.
NOTA: O número de células de macrófagos usados aqui pode ser ajustado.
3. Ensaio Transwell
NOTA: Para esta etapa, use um kit de ensaio de migração celular ou compre os reagentes e insira separadamente. Para células MV-4-11, escolha insertos Transwell com tamanho de poro de 5 μm. Para detectar a migração de macrófagos, quantifique diretamente o número de macrófagos na câmara inferior ou use métodos colorimétricos/fluorimétricos. Aqui, demonstramos o ensaio usando o método colorimétrico.
- Leve a placa de 24 poços, o inserto e os reagentes à temperatura ambiente.
- Adicione 250 μL de células MV-4-11 preparadas acima em cada inserção.
- Adicione apenas 400 μL de meio/meio condicionado (com incubação noturna a 37 °C, essas amostras servem como controle negativo) às câmaras inferiores da placa de 24 poços. Para cada linha tumoral ou controle, use amostras triplicadas. Evite bolhas entre o inserto e o meio condicionado. As bolhas inibem os macrófagos de migrar para os poços de fundo.
- Incubar as placas em uma incubadora a 37 °C com 5% de CO2 por 4 h.
NOTA: O tempo de incubação pode ser ajustado. As células que migram para as câmaras inferiores podem ser vistas ao microscópio.
- Bata suavemente no inserto na parede interna do mesmo poço e descarte o inserto. Como as células MV-4-11 crescem em suspensão, a solução de descolamento celular ou o tratamento com tripsina não são necessários aqui.
- Pipete suavemente as células dos poços para cima e para baixo 3 vezes para misturar. Transfira 225 μL de suspensão celular para uma placa de 96 poços de parede preta adequada para medição fluorescente.
- Dilua o corante CyQuant 1:75 com tampão de lise 4x. Vortex brevemente e gire a solução. Adicione 75 μL de solução a cada poço da placa de 96 poços. Incube 15 min em temperatura ambiente.
- Leia a fluorescência usando o conjunto de filtros de 480/520 nm com um leitor de placa de fluorescência.
- Analise os dados subtraindo o branco e normalizando para a linha de células tumorais de controle.
