Extração de Vesículas Extracelulares: Uma Técnica para Isolar Vesículas Extracelulares de Amostras de Tecidos Inteiros Usando Centrifugação Diferencial

Resumo

Fonte: Hurwitz, S. N. et al. Extração de Vesículas Extracelulares de Tecido Total. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo descreve a técnica de extração de vesículas extracelulares de tecidos frescos ou congelados. As vesículas extracelulares isoladas podem ser usadas para análises posteriores para descobrir seus papéis significativos na patogênese da doença.

Protocolo

1. Dissociação de Tecidos e Centrifugação Diferencial

1. Prepare 10 mL de tampão de dissociação (10 mg de papaína; 5,5 mM de L-cisteína; 67 μM de 2-mercaptoetanol; 1,1 mM de EDTA) em meio Hibernate-E para aproximadamente 0,4–1,0 g de tecido.
   NOTA: Todas as soluções utilizadas para enriquecimento e purificação de EV devem ser diluídas em água filtrada ultrapura.
2. Adicione tecido inteiro fresco ou congelado ao tampão de dissociação em um tubo cônico de 50 mL e incube em banho-maria morno a 37 ° C por 20 min. O tecido pode ser cortado em fragmentos menores antes da incubação, se necessário.
3. Após a incubação, adicione inibidores de protease e fosfatase para uma concentração final de 1x ao tampão de dissociação que contém o tecido.
4. Despeje a solução contendo o tecido em um homogeneizador Dounce solto e dissocie suavemente o tecido usando aproximadamente 30 movimentos lentos por amostra. O número de golpes pode ser ajustado com base na consistência do tecido.
5. Transferir o tecido dissociado em tampão para um tubo cónico de 50 ml e centrifugar a 500 x g durante 5 min a 4 °C para peletar as células e os fragmentos de tecido fibroso ou coesivo restantes.
6. Transfira o sobrenadante para um tubo cônico limpo de 50 mL e centrifugue a 2.000 x g por 10 min a 4 ° C para pellet e descarte grandes detritos celulares.
7. Transfira o sobrenadante novamente para um tubo cônico limpo de 50 mL e centrifugue a 10.000 x g por 40 min a 4 ° C para granular vesículas maiores indesejadas ou pequenos corpos apoptóticos.
   NOTA: Este pellet pode ser guardado para estudo adicional de vesículas maiores, se desejado.
8. Transvase o sobrenadante através de um filtro de 0,45 μm para um tubo de ultracentrifugação limpo de 12 mL.
   nota: Amostras de tecido fibrótico denso podem não ser facilmente filtradas. Essas amostras podem ser filtradas através de um filtro de células de 40 μm e, em seguida, passadas por agulhas menores em série (18 G, 20 G, 22 G) antes de filtrar pelo filtro de 0,45 μm.
9. Ultracentrifugar a amostra a 100.000 x g durante 2 h a 4 °C para pulverizar pequenos EVs.
10. Transvase o sobrenadante e deixe os tubos de ultracentrifugação invertidos por 5 a 10 min, batendo frequentemente para remover o líquido residual nas laterais dos tubos. O fluido residual também pode ser aspirado usando uma pipeta a vácuo por aspiração.
11. Ressuspenda o pellet EV em 1,5 mL de tampão sacarose 0,25 M (Tris 10 mM, pH 7,4). É importante garantir a ressuspensão total do pellet nesta etapa. Para fazer isso, cubra os tubos com parafilme antes de transformar os EVs em solução. Agite os tubos da ultracentrífuga por 15-20 min em temperatura ambiente antes de uma mistura final de vórtice.
12. Centrifugue brevemente os tubos a uma velocidade não superior a 1.000 x g para recuperar a suspensão líquida no fundo do tubo.
13. Prossiga para as etapas de purificação do gradiente abaixo ou, se necessário, armazene a suspensão EV a 4 ° C durante a noite.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Filtro de 0,45 μm	VWR	Rolamento 28145-505
Tubos de ultracentrífuga de 12 mL	Beckman Coulter	331372
Tubos de ultracentrífuga de 5,5 mL	Beckman Coulter	344057
Inibidor de fosfatase HALT (solução 100x)	ThermoFisher Scientific	Nº 78420
Inibidor de protease HALT (solução 100x)	ThermoFisher Scientific	Rolamento 78438
Hibernate E médio	ThermoFisher Scientific	A1247601
Rotor de caçamba oscilante MLS-50	Beckman Coulter	Rolamento 367280
Ultracentrífuga de bancada Optima MAX-XP	Beckman Coulter	393315