Purificação de subpopulações de vesículas extracelulares: uma técnica para purificar subpopulações de vesículas extracelulares usando ultracentrifugação com gradiente de densidade

Resumo

Fonte: Urwitz, S. N. et al. Extração de Vesículas Extracelulares de Tecido Total. J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra o método de purificação baseado em ultracentrifugação com gradiente de densidade para isolar subpopulações de vesículas extracelulares adequadas para estudos de caracterização.

Protocolo

1. Purificação de gradiente de densidade

1. Adicione 1,5 mL de iodixanol a 60% (solução estoque em água) ao tampão sacarose / Tris de 1,5 mL contendo EVs para criar uma solução final contendo 30% de iodixanol. Pipete para cima e para baixo várias vezes para misturar bem a solução.
   nota: Tenha cuidado para evitar a perda de solução na ponta da pipeta, pois a alta concentração de iodixanol é bastante viscosa.
2. Transfira a solução tampão de iodixanol a 30% contendo EVs para o fundo de um tubo de ultracentrifugação de 5,5 mL.
3. Prepare pelo menos 1,5 mL de soluções de iodixanol a 20% e 10% por amostra em água ultrapura a partir da solução estoque de iodixanol a 60%.
4. Meça 1,3 mL de iodixanol a 20% e coloque cuidadosamente em cima da camada de gradiente inferior usando uma seringa e uma agulha de 18 G. Para evitar misturar as camadas na interface de densidade, manter o bisel da agulha em contacto com o interior do tubo de ultracentrifugação logo acima do menisco e adicionar a solução gota a gota.
5. Camada de 1,2 mL de solução de iodixanol a 10% sobre a camada de iodixanol a 20% usando a mesma técnica acima.
6. Equilibre e carregue cuidadosamente os tubos de ultracentrifugação em baldes de rotor e centrifugue em um rotor de caçamba oscilante a 268.000 x g por 50 min a 4 °C. Defina as velocidades de aceleração e desaceleração da centrífuga para as taxas mínimas permitidas para evitar a ruptura das camadas de densidade.
7. Rotule dez tubos de microcentrífuga de 1,5 mL para cada amostra para corresponder às frações de 1 a 10 dos gradientes de densidade. A fração 1 é designada como a fração superior que será removida primeiro, enquanto a fração 10 é a última fração inferior removida.
8. Uma vez concluída a ultracentrifugação gradiente, remova cuidadosamente os tubos das caçambas do rotor e coloque-os em um suporte estável. Uma faixa visível de vesículas será freqüentemente vista na fração de interesse. Pipetar dez fracções de série de 490 μL do topo do gradiente para os tubos correspondentes. Haverá uma pequena quantidade de fluido restante no fundo do tubo que provavelmente contém proteínas contaminantes. Esta amostra pode ser descartada ou retida como fração 11, se desejado.
9. Meça os índices de refração das frações usando um refratômetro. Isso também pode ser realizado com um gradiente de controle executado em paralelo se a conservação da amostra for necessária. Pipete 20–30 μL de cada fração contendo iodixanol na superfície do refratômetro e estime a densidade comparando os índices de refração com as densidades conhecidas de iodixanol.
   nota: As frações podem ser armazenadas durante a noite na solução contendo iodixanol, se necessário, antes de prosseguir para a próxima etapa de lavagem por ultracentrifugação.
10. Transferir cada fracção para um tubo de ultracentrifugação limpo de 12 ml. Adicione 5 mL de 1x solução salina tamponada com fosfato (PBS; 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na₂HPO₄, 2 mM KH₂PO₄, pH 7,4) ao tubo e misture pipetando lentamente para cima e para baixo.
    NOTA: O PBS adicionado às amostras deve ser livre de partículas, garantido pela filtragem do PBS estéril através de um filtro de 0.22 μm e armazenamento em temperatura ambiente para evitar precipitação de sal.
11. Adicione mais 6 mL de 1x PBS ao topo e misture novamente com cuidado.
12. Ultracentrifugar os tubos a 100.000 x g durante 2 h a 4 °C para voltar a granular pequenas vesículas. Transvasar o sobrenadante e secar os tubos antes da lise das vesículas para análise de proteínas ou ressuspensão de EVs para análise morfológica.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Filtro de 0,45 μm	VWR	Rolamento 28145-505
Tubos de ultracentrífuga de 12 mL	Beckman Coulter	331372
Tubos de ultracentrífuga de 5,5 mL	Beckman Coulter	344057
Rotor FA-45-6-30	Eppendorf	5820715006
Rotor de caçamba oscilante MLS-50	Beckman Coulter	Rolamento 367280
Ultracentrífuga de bancada Optima MAX-XP	Beckman Coulter	393315
Ultracentrífuga Optima XE-100	Beckman Coulter	A94516
Optiprep	sigma	D1556	60% de iodixanol em solução aquosa estéril
Refracto 30PX (refratômetro)	Mettler Toledo	51324650
Rotor S-4-104	Eppendorf	5820759003
Rotor de caçamba oscilante SW 41 Ti	Beckman Coulter	Rolamento 333790
Centrífuga de mesa 5804R	Eppendorf	22623508