Geração de células-tronco neurais induzidas (iNSCs) a partir de células mononucleares do sangue periférico (PBMNCs): um procedimento baseado em vírus de Sendai para reprogramar PBMNCs em iNSCs

Resumo

Fonte: Zheng, W. et al. Geração de células-tronco neurais induzidas a partir de células mononucleares periféricas e diferenciação em direção a precursores de neurônios dopaminérgicos para estudos de transplante.J. Vis. Exp. (2019)

Este vídeo demonstra a reprogramação de células mononucleares do sangue periférico (PBMNCs) em células-tronco neurais induzidas (iNSCs) usando o vírus Sendai. O vírus Sendai é um vírus não integrador que oferece um veículo eficiente e seguro para a reprogramação de células.

Protocolo

1. Reprogramação de PBMNCs para iNSCs por infecção por SeV

1. Preparação da solução e do meio de cultura
   1. Preparar uma solução-mãe de poli-D-lisina (PDL) dissolvendo 100 mg de PDL com 100 ml de H₂O até uma concentração de 1 mg/ml. Conservar a -20 °C em alíquotas de 1 ml.
   2. Prepare uma solução estoque de insulina dissolvendo 100 mg de insulina em 20 mL de HCl 0,01 N até uma concentração de 5 mg / mL. Conservar a -20 °C em alíquotas de 1 ml.
   3. Para preparar 200 mL de meio basal iNSC, combine 96 mL de DMEM-F12 e 96 mL de meio básico (Tabela de Materiais) com 2 mL de solução estoque de glutamina 100x, 2 mL de aminoácido não essencial (NEAA), 2 mL de suplemento de N2 e 2 mL de suplemento de B27. Adicione 10 ng/mL de fator inibidor de leucemia humana recombinante, 3 μM CHIR99021 e 2 μM SB431542 antes do uso. Filtrar o meio e conservá-lo a 4 °C.
      nota: Use o meio dentro de 2 semanas. Adicione o fator inibidor da leucemia humana recombinante, CHIR99021 e SB431542 imediatamente antes do uso.
2. Reprogramação de PBMNCs para iNSCs por infecção por SeV
   1. Esterilize por ultravioleta uma bancada limpa antes de usar. Esterilize todas as superfícies e equipamentos com álcool 75%. Esterilize todas as pontas usando uma autoclave.
   2. No dia 0, colete as células em meio MNC e transfira para um tubo cônico de 15 mL. Centrifugue as células a 200 x g por 5 min. Aspire o sobrenadante e ressuspenda as células com 1 mL de meio MNC pré-aquecido.
   3. Conte as células viáveis com azul de tripano. Ressuspender as células com meio MNC pré-aquecido (37 °C) até uma concentração de 2 x^10,5 células por alvéolo em placas de 24 poços.
   4. Depois de remover os tubos de SeV do armazenamento a -80 °C, descongele os tubos contendo SeV em banho-maria a 37 °C por 5 a 10 s e, em seguida, deixe-os descongelar em RT. Depois de descongelados, coloque-os no gelo imediatamente.
   5. Adicione o SeV que codifica Klf4 humano, Oct3/4, SOX2 e c-MyC aos poços, em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 10. Centrifugue as células com placas a 1.000 x g por 30 min para facilitar a fixação das células. Deixe as células e o sobrenadante nas placas. Coloque as placas na incubadora a 37 °C, 5% CO₂.
      CUIDADO: Todos os procedimentos que envolvem SeV devem ser realizados em uma cabine de segurança, e todas as pontas e tubos devem ser tratados com etanol ou alvejante antes do descarte.
   6. No dia 1, transfira o meio e as células para um tubo de centrífuga de 15 mL. Enxágue o poço com 1 mL de meio MNC. Centrifugue a suspensão celular a 200 x g por 5 min. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as células com 500 μL de meio MNC fresco pré-aquecido em placas de 24 poços.
      nota: Use uma placa de 24 poços de fixação baixa para evitar a fixação de quaisquer células antes de plaquear em PDL / laminina.
   7. No dia 2, diluir 1 mL de 1 mg/mL de PDL com 19 mL de D-PBS até uma concentração de 50 μg/mL. Cubra as placas de 6 poços com 50 μg/mL PDL por pelo menos 2 h em RT.
   8. Diluir 200 μL de 0,5 mg / mL de laminina com 20 mL de D-PBS para uma concentração de 5 μg / mL. Aspire PDL nas placas de 6 poços e seque na bancada vertical limpa.
   9. Cubra as placas de 6 poços com 5 μg / mL de laminina e incube por 4–6 h a 37 ° C. Lave com D-PBS antes de usar.
   10. No dia 3, coloque as células transduzidas obtidas na etapa 1.2.6 em meio iNSC em placas de 6 poços revestidas com PDL/laminina.
       nota: Mova as placas com cuidado, se necessário, depois que as células forem colocadas em placas revestidas com PDL/laminina, tentando não perturbar a fixação das células.
   11. No dia 5, adicione 1 mL de meio iNSC pré-aquecido (37 °C) em cada poço em placas de 6 poços suavemente.
       nota: Espera-se que as células sofram uma morte drástica (>60%).
   12. No dia 7, adicione 1 mL de meio iNSC pré-aquecido (37 ° C) em cada poço em placas de 6 poços suavemente.
   13. Do dia 9 ao dia 28, substitua o meio gasto por meio iNSC fresco pré-aquecido (37 ° C) todos os dias. Monitore o surgimento de colônias iNSC. Escolha e transfira clones do iNSC para expansão em cerca de 2 a 3 semanas. Colher colónias com morfologia adequada utilizando pipetas de vidro queimado, excluindo as células possivelmente contaminantes, e aspirar as colónias com pontas de 200 μl.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Suplemento B27	Invitrogen	17504044
CHIR99021	Operação Gênica	Rolamento 04-0004
DMEM-F12	Gibco	11330
DMEM-F12	Gibco	11320
Laminina	Roche	11243217001
Suplemento N2	Invitrogen	17502048
NEAA	Invitrogen	11140050	Aminoácido não essencial
Neurobasal	Gibco	Rolamento 10888	Meio básico
Pdl	Sigma-Aldrich	Pág. 7280	Poli-D-lisina
SB431542	Operação Gênica	04-0010-10mg	Armazenar da luz em -20?
Vírus Sendai	Tecnologias da Vida	MAN0009378
insulina	Roche	12585014
Placa de 24 poços	Corning	Rolamento 3337
Tubo cônico de 15 ml	Corning	430052
Placa de 6 poços	Corning	3516
EPO	Peprotech	100-64-50UG	Eritropoietina Humana
Fator inibidor da leucemia humana	Moinho	LIF1010
SCF recombinante humano	Peprotech	300-07-100UG
IGF-1	Peprotech	100-11-100UG	Fator de crescimento semelhante à insulina humana
IL-3	Peprotech	200-03-10UG	Interleucina humana 3
dexametasona	Sigma-Aldrich	D2915-100MG
IMDM	Gibco	Rolamento 215056-023	Iscove modificou o meio de Dulbecco
insulina	Roche	12585014
ITS-X	Invitrogen	Rolamento 51500-056	Suplemento de insulina-transferrina-selênio-X
GlutaMAX	Invitrogen	21051024	100 × solução de estoque de glutamina
Presunto-F12	Gibco	11765-054
1-Tioglicerol	Sigma-Aldrich	M6145	Tóxico para inalação e contato com a pele
ácido ascórbico	Sigma-Aldrich	A92902	Tóxico com contato com a pele
Reposição de soro knockout	Gibco	10828028	Meio basal livre de soro
Concentrado lipídico quimicamente definido	Invitrogen	11905031
Transferrina	Sistemas de P&D	2914-HT-100G
Azul de tripano	Gibco	T10282