Isolamento de DNA livre de células circulantes (cfDNA): um procedimento de membrana à base de sílica para extrair cfDNA do plasma sanguíneo de pacientes com câncer

Resumo

Fonte: Palande, V. et al. Detecção de DNA livre de células em amostras de plasma sanguíneo de pacientes com câncer. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo descreve um procedimento de membrana à base de sílica para isolar DNA livre de células circulantes ou cfDNA de amostra de plasma humano. O cfDNA é um biomarcador promissor para o diagnóstico e avaliação do câncer.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Purificação do cfDNA circulante de 1 mL de plasma

NOTA: Esta etapa é realizada com um kit comercial (consulte a Tabela de Materiais). Todos os buffers são fornecidos com o kit.

1. Preparação de tampões e reagentes
   cuidado: Não adicione soluções ácidas ou alvejante diretamente aos resíduos de preparação da amostra. Os sais de guanidina presentes no tampão de lise, tampão de ligação e tampão de lavagem-1 quando combinados com alvejante ou ácidos podem produzir compostos altamente reativos.
   1. Tampão de ligação: Misture 300 mL de concentrado de tampão de ligação com 200 mL de isopropanol 100% para fazer 500 mL de tampão de ligação de trabalho. Armazenar em temperatura ambiente.
      nota: O tampão de ligação permite a ligação ideal dos ácidos nucléicos circulantes à membrana de sílica. 500 mL do tampão de ligação são suficientes para processar 276, 138, 92, 69 ou 55 amostras de 1, 2, 3, 4 ou 5 mL de plasma, respectivamente, e são estáveis por 1 ano à temperatura ambiente.
   2. Tampão de lavagem-1: Misture 19 mL de concentrado de tampão de lavagem-1 com 25 mL de etanol a 96–100% para fazer 44 mL de tampão de lavagem-1 de trabalho. Armazenar em temperatura ambiente.
      nota: O tampão de lavagem-1 elimina os contaminantes ligados à membrana de sílica. 44 mL de tampão de lavagem de trabalho-1 são suficientes para processar 73 amostras de 1/2/3/4/5 mL de plasma e são estáveis por 1 ano à temperatura ambiente.
   3. Tampão de lavagem-2: Misture bem 13 mL de concentrado de tampão de lavagem-2 com 30 mL de etanol a 96–100% para fazer 43 mL de tampão de lavagem-2 de trabalho. Armazenar em temperatura ambiente.
      nota: O tampão de lavagem-2 elimina os contaminantes ligados à membrana de sílica. 43 mL de Wash Buffer-2 de trabalho são suficientes para processar ~ 56 amostras de 1/2/3/4/5 mL de plasma e são estáveis por 1 ano à temperatura ambiente.
   4. A um tubo contendo 310 μg de RNA transportador liofilizado, adicione 1.550 μL de tampão de eluição, para preparar uma solução de RNA transportador de 0,2 μg/μL. Depois de dissolver completamente o RNA transportador, dividir a solução em alíquotas adequadas e armazenar a -30 °C a -15 °C. Não congele e descongele essas alíquotas mais de 3 vezes. Ao tampão de lise, conforme mostrado na Tabela 1, adicione o RNA transportador reconstituído dissolvido no tampão de eluição.
      nota: Como o RNA transportador não se dissolve diretamente no tampão de lise, ele precisa ser dissolvido primeiro em um tampão de eluição e depois no tampão de lise. Em primeiro lugar, a ligação entre membrana de sílica e ácidos nucléicos é aumentada quando há muito poucas moléculas-alvo presentes na amostra. Em segundo lugar, o risco de degradação do RNA é reduzido devido à presença de grandes quantidades de RNA transportador.
2. Antes de iniciar o isolamento, leve as colunas e amostras à temperatura ambiente e ajuste os volumes da amostra para 1 mL com solução salina estéril tamponada com fosfato (PBS), se necessário. Pré-aqueça 2 banhos-maria ou blocos de aquecimento que contenham tubos de centrífuga de 50 mL e tubos de coleta de 2 mL a 60 °C e 56 °C, respectivamente.
3. Em um tubo de centrífuga de 50 mL, adicione 100 μL de proteinase K, 1 mL de plasma e 0,8 mL de tampão de lise contendo 1,0 μg de RNA transportador (preparado na etapa 1.1.4). Feche o tubo da centrífuga com uma tampa e misture o conteúdo por vórtice de pulso por 30 s, garantindo um vórtice visível no tubo. A mistura completa do conteúdo é importante para uma lise eficiente.
   nota: Imediatamente após o vórtice, prossiga para a etapa 1.4, sem demora.
4. Incubar a solução a 60 °C durante 30 min.
5. Remova a tampa, adicione 1,8 mL do tampão de ligação ao tubo e misture bem com o vórtice de pulso por 15 a 30 s após colocar a tampa.
6. Incube a mistura resultante por 5 min em gelo e insira a coluna de membrana de sílica no aparelho de vácuo que está conectado à bomba de vácuo. Em seguida, insira firmemente um extensor de tubo de 20 mL na coluna aberta para evitar vazamento de amostra.
7. Despeje cuidadosamente a mistura incubada no extensor de tubo da coluna e ligue a bomba de vácuo. Depois que toda a mistura de lisado passar completamente pelas colunas, desligue a bomba de vácuo, libere a pressão para 0 mbar, remova e descarte o extensor de tubo.
   nota: Evitando contaminação cruzada, o extensor de tubo deve ser descartado com cuidado, para evitar que se espalhe sobre colunas adjacentes.
8. Remova a coluna do aparelho de vácuo, insira no tubo de coleta e centrifugue a 11.000 x g por 30 s à temperatura ambiente, para remover qualquer lisado residual. Descarte o fluxo.
9. Adicione 600 μL de tampão de lavagem-1 na coluna, centrifugue a 11.000 x g por 1 min em temperatura ambiente, descarte o fluxo.
10. Adicione 750 μL de tampão de lavagem-2 à coluna, centrifugue a 11.000 x g por 1 min em temperatura ambiente e descarte o fluxo.
11. Adicione 750 μL de etanol (96-100%) à coluna, centrifugue a 11.000 x g por 1 min à temperatura ambiente e descarte o fluxo.
12. Centrifugue a coluna a 20.000 x g por 3 min, colocando-a em um tubo de coleta limpo de 2 mL.
13. Seque completamente o conjunto da coluna de membrana, colocando-o em um novo tubo de coleta de 2 mL com a tampa aberta e incubando a 56 °C por 10 min.
14. Coloque a coluna em um tubo de eluição limpo de 1,5 mL. No centro da membrana da coluna, aplique 20–150 μL de tampão de eluição e incube em temperatura ambiente por 3 min com a tampa fechada.
    nota: Certifique-se de que o tampão de eluição esteja equilibrado à temperatura ambiente. No caso de usar tampão de eluição inferior a 50 μL, certifique-se de que ele seja dispensado cuidadosamente no centro da membrana. Isso ajuda na eluição completa do DNA ligado. No entanto, o volume de eluição não é fixo e pode ser alterado de acordo com as aplicações a jusante. O eluato recuperado pode ser de até 5 μL e certamente menor que o volume de eluição aplicado à coluna.
15. Centrifugue o eluído recuperado em uma microcentrífuga a 20.000 x g por 1 min para eluir os ácidos nucléicos e armazene a -20 °C.

Número da amostra	Tampão de lise (mL)	RNA transportador em tampão de eluição (μL)
1	0,9	5.6
algarismo	1.8	11.3
3	2.6	16.9
4	3.5	22,5
5	4.4	28.1
6	5.3	33.8
7	6.2	39.4
8	7	45
9	7.9	50.6
10	8.8	56.3
11	9.7	61.9
12	10.6	67,5
13	11.4	73.1
14	12.3	78,8
15	13.2	84.4
16	14.1	90
17	15	95.6
18	15.8	101.3
19	16.7	106,9
20	17.6	112,5
21	18.5	118.1
22	19.4	123,8
23	20.2	129,4
24	21.1	135

Tabela 1. Volumes de tampão de lise e RNA transportador (dissolvido no tampão de eluição) necessários para o processamento de amostras de plasma de 1 mL.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de DNA de alta sensibilidade Agilent	Agilent Technologies, Inc.	Rolamento 5067-4626	Os ensaios de DNA de alta sensibilidade são frequentemente usados para controle de qualidade de amostras para bibliotecas de sequenciamento de última geração.
cf-DNA / cf-RNA Tubos Conservantes	Norgen Biotek Corp.	Nº 63950	Os tubos conservantes cf-DNA/cf-RNA da Norgen são tubos de plástico fechados e evacuados para a coleta e preservação de cfDNA, DNA tumoral circulante, cf-RNA e células tumorais circulantes em amostras de sangue total humano durante o armazenamento e transporte
Kit de ácido nucleico circulante QIAamp	Qiagen	Rolamento 55114	O Kit de Ácido Nucleico Circulante QIAamp permite a purificação eficiente desses ácidos nucleicos circulantes do plasma ou soro humano e outros fluidos corporais livres de células.
Coletor de vácuo QIAvac 24 Plus	Qiagen	Rolamento 19413	O coletor de vácuo QIAvac 24 Plus foi projetado para o processamento a vácuo de colunas QIAGEN em paralelo.
Sistema de conexão QIAvac	Qiagen	Rolamento 19419	Em combinação com o sistema de conexão QIAvac, o coletor de vácuo QIAvac 24 Plus pode ser usado como um sistema de fluxo. O fluxo da amostra, contendo material possivelmente infeccioso, é coletado em um frasco de resíduos separado.
Sistema de conexão QIAvac	Qiagen	Rolamento 19419	Em combinação com o sistema de conexão QIAvac, o coletor de vácuo QIAvac 24 Plus pode ser usado como um sistema de fluxo. O fluxo da amostra, contendo material possivelmente infeccioso, é coletado em um frasco de resíduos separado.
variado
Tubos de centrífuga de 50 mL
Gelo picado
Etanol (96–100%)
Bloco de aquecimento ou similar a 56 °C (capaz de conter tubos de coleta de 2 mL)
Isopropanol (100%)
Microcentrífuga
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)
Pipetas (ajustáveis)
Ponteiras de pipeta estéreis (ponteiras de pipeta com barreiras de aerossol são recomendadas para ajudar a evitar a contaminação cruzada)
Banho-maria ou bloco de aquecimento capaz de conter tubos de centrífuga de 50 mL a 60 °C