Análise automatizada de distribuição de tamanho de fragmentos baseada em eletroforese capilar de cfDNA: um método baseado em microchip de DNA para estudar a distribuição de tamanho de fragmentos de DNA isolados de biofluidos

Resumo

Fonte: Palande, V. et al. Detecção de DNA livre de células em amostras de plasma sanguíneo de pacientes com câncer. J. Vis. Exp. (2020)

Neste vídeo, analisamos a distribuição de tamanho de fragmentos de DNA livre de células ou cfDNA usando eletroforese capilar automatizada. Essa técnica ajuda a obter informações sobre o perfil de fragmentos de DNA liberados por células cancerígenas durante a apoptose.

Protocolo

1. Distribuição do tamanho do fragmento de DNA do cfDNA pelo analisador de fragmentos

1. A etapa antes de iniciar o procedimento: Equilibre o concentrado de corante de DNA e a matriz de gel de DNA à temperatura ambiente por 30 min.
2. Preparação da mistura gel-dye
   nota: Manuseie as soluções com cuidado, pois o DMSO é conhecido por facilitar a entrada de moléculas orgânicas nos tecidos.
   1. Descongele completamente o DMSO por vórtice o frasco para injetáveis de concentrado de corante de DNA por 10 s. Pipete 15 μL deste concentrado para um frasco de matriz de gel de DNA e armazene a 4 ° C no escuro.
   2. Novamente, vortex o frasco tampado por 10 s até que a mistura do gel e do corante seja visualizada.
   3. Despeje a mistura em um filtro de centrifugação no recipiente superior.
   4. Microcentrifugar o filtro de rotação a 2.240 x g ± 20% por 10 min à temperatura ambiente.
   5. Rotule o corante de gel preparado no tubo e descarte o filtro, de acordo com as boas práticas de laboratório. Rotule o tubo e registre a data de preparação.
      nota: Rejeitar o filtrado de acordo com as boas práticas de laboratório. A mistura de gel-corante pode ser usada para 5 chips de DNA de alta sensibilidade (HS). Se não for usado por mais de 1 h, armazene a 4 °C. O armazenamento no escuro é possível por até 6 semanas.
3. Para carregar a mistura de gel-dye, certifique-se da posição da placa de base da estação de primer de cavacos e ajuste o clipe na posição mais baixa.
   1. Equilibre a mistura de gel-corante à temperatura ambiente por 30 min, enquanto monitora a exposição à luz.
   2. Pegue um novo chip de DNA HS de um saco lacrado e coloque-o na estação de preparação do chip, remova 9,0 μL da mistura de gel-corante e dispense-o na parte inferior do poço do chip, marcado como 'G'.
      nota: Retire a mistura de gel e corante, evitando partículas que possam acumular-se no fundo do frasco para injetáveis. Ao dispensar a mistura de gel-corante no poço do chip de DNA HS, insira a ponta da pipeta completamente para evitar a formação de grandes bolhas de ar. Além disso, tocar a pipeta nas bordas do poço produzirá resultados ruins.
   3. Posicione o êmbolo em 1 mL e feche a estação de escorva de cavacos. Certifique-se de que a trava da trava clique e ajuste o temporizador para 60 s, depois pressione o êmbolo para baixo até que seja segurado pelo clipe e, exatamente após 60 s, solte o êmbolo com o mecanismo de liberação do clipe.
   4. Quando o êmbolo recuar pelo menos para a marca de 0,3 mL, aguarde 5 s e, em seguida, puxe lentamente de volta para a posição de 1 mL, abra a estação de escorva do chip e remova novamente 9,0 μL da mistura de gel-corante e dispense na parte inferior do poço do chip de DNA HS, marcado como 'G'.
4. Para carregar o marcador de DNA, dispense 5 μL do marcador de DNA no poço, marcado com o símbolo da escada. Repita o procedimento para todos os 11 alvéolos de amostra.
5. Para carregar a escada e as amostras, dispense 1 μL da escada de DNA no poço, marcada com o símbolo da escada, e adicione 1 μL de amostra (poços usados) ou 1 μL de marcador (poços não utilizados) em todos os 11 poços de amostra.
6. Vortex o chip HS DNA por 60 s a 2.400 rpm, colocando o chip horizontalmente no adaptador. Certifique-se de que a protuberância que fixa o chip de DNA HS não seja danificada durante o vórtice.
7. Para inserir o chip de DNA HS no instrumento analisador de fragmentos, abra a tampa e certifique-se de que o cartucho do eletrodo esteja inserido corretamente e que o seletor de chip esteja posicionado em 'dsHigh Sensitivity DNA' no instrumento analisador de fragmentos.
8. Monte cuidadosamente o chip de DNA HS no receptáculo, que se encaixa apenas de uma maneira, depois feche a tampa certificando-se de que o cartucho do eletrodo se encaixe exatamente nos poços do chip de DNA HS.
9. A tela do software analisador de fragmentos indica o chip de DNA HS inserido e a tampa fechada através do ícone do chip no canto superior esquerdo da tela.
10. Para iniciar a execução do chip HS DNA, selecione o Ensaio de Alta Sensibilidade dsDNA no menu 'Ensaio' na tela do instrumento, preencha corretamente a tabela de nomes de amostra alimentando informações como nomes de amostra e comentários e inicie a execução do chip clicando no botão 'Iniciar' no canto superior direito da tela.
11. Limpeza do eletrodo após a execução de um chip de DNA HS: Remova imediatamente o chip de DNA HS usado assim que o ensaio for concluído e descarte-o de acordo com as boas práticas de laboratório. Execute o procedimento a seguir para garantir que os eletrodos estejam limpos, sem resíduos do ensaio anterior.
    1. Encha lentamente 350 μL de água deionizada de grau de análise em um dos poços de limpeza de eletrodos e coloque o limpador de eletrodos no instrumento analisador de fragmentos abrindo a tampa e, em seguida, feche a tampa e aguarde cerca de 10 s.
    2. Remova o limpador de eletrodos abrindo a tampa e espere mais 10s para que a água nos eletrodos evapore antes de fechar a tampa.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Instrumento Bioanalisador 2100	Agilent Technologies, Inc.	G2939BA	O sistema 2100 Bioanalyzer é uma ferramenta de eletroforese automatizada estabelecida para o controle de qualidade de amostras de biomoléculas.
Clipe ajustável para estação de escorva	Agilent Technologies, Inc.	Rolamento 5042-1398	Usado em combinação com a seringa para aplicar a pressão definida para a preparação de cavacos.
cf-DNA / cf-RNA Tubos Conservantes	Norgen Biotek Corp.	Nº 63950	Os tubos conservantes cf-DNA/cf-RNA da Norgen são tubos de plástico fechados e evacuados para a coleta e preservação de cf-DNA, DNA tumoral circulante, cf-RNA e células tumorais circulantes em amostras de sangue total humano durante o armazenamento e transporte
Estação de preparação de cavacos	Agilent Technologies, Inc.	Rolamento 5065-4401	Usado para carregar a matriz de gel em um chip com uma seringa fornecida com cada kit de ensaio - usado para ensaios de RNA, DNA e proteína. Inclui estação de escorva, cronômetro e 1 clipe de seringa
Kit de limpeza de eletrodos	Agilent Technologies, Inc.	Rolamento 5065-9951	Previne a contaminação cruzada. Remove contaminantes bacterianos ou proteicos dos eletrodos.
Filtros para Matriz de Gel	Agilent Technologies, Inc.	185-5990	Usado para a mistura adequada do concentrado de corante de DNA e da matriz de gel de DNA
Vórtice de chip básico IKA	IKA-Werke GmbH & Co. KG	MS-3-S36	Usado para mistura adequada de escada de DNA e amostra de DNA em chips de ensaio Bioanalyzer
Tubos de centrífuga de 50 ml
Etanol (96–100%)
Bloco de aquecimento ou similar a 56 °C (capaz de conter tubos de colheita de 2 ml)
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)
Pipetas (ajustáveis)
Ponteiras de pipeta estéreis (ponteiras de pipeta com barreiras de aerossol são recomendadas para ajudar a evitar a contaminação cruzada)
Banho-maria ou bloco de aquecimento capaz de conter tubos de centrífuga de 50 mL a 60 °C