Reação em cadeia da polimerase digital de gotículas: um método para gerar reações de PCR de nanogotículas para detectar mutações tumorais raras

Resumo

Fonte: Bonner, E. R. et al. Detecção e monitoramento de DNA circulante associado a tumores em biofluidos de pacientes. J. Vis. Exp. (2019)

Neste vídeo, apresentamos um procedimento passo a passo para gerar nanogotículas emulsionadas para detectar ácidos nucléicos alvo por reação em cadeia da polimerase digital ou dPCR.

Protocolo

1. Detecção e quantificação do DNA alvo usando dPCR

1. Prepare a mistura de reação de dPCR para 8 poços do tubo de tira de PCR mais 10% extra, adicionando 220 μL de master mix de genotipagem, 8,8 μL de cada uma das sondas selvagens e mutantes de 10 μM, 39,6 μL de 10 μM de primers direto e reverso e 17,6 μL de óleo estabilizador de gotículas.
2. Misture delicadamente a mistura de reação de dPCR pipetando o volume total para cima e para baixo 10 a 20 vezes. Não vórtice ou centrifugue após o óleo estabilizador de gotículas ter sido adicionado à mistura de reação.
3. Obtenha um tubo de tira de PCR de 8 poços e dispense 38 μL de mistura de reação de dPCR diretamente no fundo de cada poço. Remova todas as bolhas com uma ponta de pipeta limpa.
   NOTA: Os tubos de tiras de PCR intertravados ou compactados podem resultar em cargas elétricas estáticas, causando coalescência e sinal ruidoso ao analisar os dados de dPCR. Para evitar isso, alíquota tira os tubos em sacos separados de risco biológico, evite embalar demais os sacos e evite que os tubos se esfreguem.
4. Adicione 12 μL de amostra de DNA pré-amplificada aos poços apropriados do tubo de tira de PCR. Para o controle negativo, adicione 12 μL de MB H₂O.
   NOTA: Analise amostras de cfDNA em poços replicados. Para o LCR, analise pelo menos em duplicado e, para plasma/soro, analise cada amostra em triplicata.
5. Pipetar suavemente o volume total para cima e para baixo 10 vezes para misturar a mistura de reacção com a amostra de ADN.
6. Obtenha um novo chip de instrumento gerador de gotículas e pipete o volume total dos poços 1–8 do tubo de tira de PCR para os canais correspondentes A–H no chip. Evite tocar no fundo dos canais com uma ponta de pipeta.
7. Obtenha um novo tubo de tira de PCR limpo e insira no instrumento gerador de gotículas. Digitalize ou insira manualmente o ID do chip do instrumento gerador de gotículas no software do computador do instrumento. Digite nomes para cada um dos 8 canais. Clique em Iniciar a execução para começar a dropletizar amostras.
8. Quando a dropletização estiver concluída, remova o tubo de tira de PCR e aplique as tampas do tubo de tira.
9. Transfira o tubo de tira para um termociclador e equilibre com outro tubo de tira contendo 80 μL de água por poço.
10. Programe as condições de ciclagem térmica como: 95 °C por 10 min; 45 ciclos de duas temperaturas: 95 °C por 30 s e temperatura de recozimento por 2 min; 98 °C por 10 min; e mantenha a 10 °C.
    1. Defina a taxa de rampa para 0,5 °C/s e defina o volume da amostra para 80 μL.
11. Quando o ciclo térmico estiver concluído, remova o tubo de tira e transfira para o instrumento de quantificação. Remova as tampas das tiras de PCR e substitua por tampas de alta velocidade.
12. Ligue o instrumento de quantificação e o computador conectado com o software do instrumento. Inicie o software do instrumento e clique em Configurar uma corrida.
13. Coloque o tubo de tira no instrumento de quantificação.
14. Obtenha um novo chip de instrumento de quantificação e digitalize ou insira manualmente o ID do chip no instrumento. Insira o chip na máquina.
15. Coloque a blindagem de metal em cima do chip e feche a tampa do instrumento.
16. No software do computador, insira um nome para a execução de dPCR e para cada um dos 8 canais (A–H). Selecione o modo Rápido (que deve ser usado com limites de alta velocidade) e clique em Iniciar para iniciar a quantificação.
17. Quando a quantificação estiver concluída, remova a blindagem de metal (para ser salva e reutilizada) e descarte o tubo de tira de PCR e o chip. No computador do instrumento, o Run Log conterá arquivos de resultados para cada execução. Use os arquivos .fcs para cada amostra para analisar com o software analista.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de Consumíveis Raindance	Bio-Rad	20-04411	Contém chips de instrumentos geradores de gotículas, chips de instrumentos de quantificação, tampas de tiras de PCR, incluindo tampas de alta velocidade e óleo estabilizador de gotículas
Instrumento Raindance Sense	Bio-Rad		Instrumento de quantificação
Instrumento de fonte de dança da chuva	Bio-Rad		Instrumento gerador de gotículas
Software RainDrop Analyst II	Tecnologias RainDance		Software de análise usado para análise de dados
Termomisturador C	Eppendorf	14 285 562PM
Termociclador MiniAmp	Thermofisher Científico	Rolamento A37834
Tampas de tubo de tira de 8 poços PCR	VWR	10011-786
Tubos de tira de 8 poços PCR	Axygen	PCR-0208-C
Q5 Hot Start High Fidelity 2x Master Mix	Nova Inglaterra Biolabs Inc	M0494S