Reação em cadeia da polimerase digital de gotículas: um método para gerar reações de PCR de nanogotículas para detectar mutações tumorais raras

Resumo

Fonte: Bonner, E. R. et al. Detecção e monitoramento de DNA circulante associado a tumores em biofluidos de pacientes. J. Vis. Exp. (2019)

Neste vídeo, apresentamos um procedimento passo a passo para gerar nanogotículas emulsionadas para detectar ácidos nucléicos alvo por reação em cadeia da polimerase digital ou dPCR.

Protocolo

1. Detecção e quantificação do DNA alvo usando dPCR

1. Prepare a mistura de reação de dPCR para 8 poços do tubo de tira de PCR mais 10% extra, adicionando 220 μL de master mix de genotipagem, 8,8 μL de cada uma das sondas selvagens e mutantes de 10 μM, 39,6 μL de 10 μM de primers direto e reverso e 17,6 μL de óleo estabilizador de gotículas.
2. Misture delicadamente a mistura de reação de dPCR pipetando o volume total para cima e para baixo 10 a 20 vezes. Não vórtice ou centrifugue após o óleo estabilizador de gotículas ter sido adicionado à mistura de reação.
3. Obtenha um tubo de tira de PCR de 8 poços e dispense 38 μL de mist....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de Consumíveis Raindance	Bio-Rad	20-04411	Contém chips de instrumentos geradores de gotículas, chips de instrumentos de quantificação, tampas de tiras de PCR, incluindo tampas de alta velocidade e óleo estabilizador de gotículas
Instrumento Raindance Sense	Bio-Rad		Instrumento de quantificação
Instrumento de fonte de dança da chuva	Bio-Rad		Instrumento gerador de gotículas
Software RainDrop Analyst II	Tecnologias RainDance		Software de análise usado para análise de dados
Termomisturador C	Eppendorf	14 285 562PM
Termociclador MiniAmp	Thermofisher Científico	Rolamento A37834
Tampas de tubo de tira de 8 poços PCR	VWR	10011-786
Tubos de tira de 8 poços PCR	Axygen	PCR-0208-C
Q5 Hot Start High Fidelity 2x Master Mix	Nova Inglaterra Biolabs Inc	M0494S