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1. Cultura de células e preparação de andaimes
NOTA: Os andaimes devem ser preparados 48 h antes da implantação em camundongos. Os volumes a seguir são fornecidos por andaime. Multiplique as quantidades conforme necessário para andaimes adicionais.
- Corte os andaimes de poli(ácido lático) (PLA) em pedaços do tamanho de uma cavidade de ressecção (aproximadamente 2 mm x 2 mm). Os andaimes podem ser cortados à mão usando uma tesoura ou usando um furador para repetibilidade.
- Esterilize por imersão em etanol 70% por 15 min seguido de imersão em PBS. Coloque o andaime no meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) contendo 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina enquanto prepara as células para a semeadura.
- Levante as MSCs cultivadas usando 0,05% de tripsina (3–5 mL para um frasco T75). Incubar a 37 °C durante 5 min. Certifique-se de que as células foram levantadas e, em seguida, adicione 7 a 10 mL de DMEM ao frasco para inativar a tripsina.
- Transferir o conteúdo do balão para um tubo de centrifugação de 15 ml. Conte as células usando um hemocitômetro. Pellet 5 x 105 MSCs para cada andaime por centrifugação a 100 x g por 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e ressuspender as MSCs em 5 μL de DMEM por 5 x 105 células.
- Prepare os andaimes para a semeadura, secando-os.
- Remova um andaime da imersão em DMEM com uma pinça e coloque-o temporariamente na tampa da placa de 6 poços. Levante o andaime da tampa, deixando para trás uma gota de excesso de DMEM.
- Coloque o andaime de volta na tampa novamente em um local novo e seco. Repita 3-5 vezes e, em seguida, coloque o andaime parcialmente seco em uma nova placa de 6 poços para semeadura. Repita para cada andaime.
nota: Um andaime parcialmente seco fornece resultados ideais de semeadura celular. Se o andaime estiver muito úmido, as células deslizarão para fora do andaime e aderirão à placa do poço abaixo. Se o andaime estiver muito seco, a gotícula não se espalhará por todo o andaime, resultando em má distribuição celular inicial.
- Usando uma pipeta, misture suavemente o frasco de células-tronco para homogeneizar a suspensão, pois algumas células podem ter se acomodado no fundo.
- Pipete lentamente 2,5 μL de suspensão MSC recém-misturada diretamente no andaime, criando uma pequena gota sobre o topo do andaime.
- Adicione 300 μL de DMEM às bordas de cada poço. Isso evitará a evaporação rápida da gotícula celular. Incubar a 37 °C durante 30 min, permitindo que as células se fixem ao andaime.
- Com uma pinça, vire suavemente os andaimes na placa do poço. Semear 2,5 μL de suspensão de MSC recém-misturada (isso resulta em um total de 5 x 105 células semeadas por andaime). Incubar a 37 °C durante 30 min, permitindo que as células se fixem ao andaime.
- Cubra os andaimes com DMEM adicionando 2 mL a cada poço da placa de 6 poços. Levante suavemente os andaimes para permitir que a mídia flua por baixo deles. Incubar a 37 °C neste estado durante 48 h antes da cirurgia de implantação.
- Verifique os andaimes após 24 h e adicione/troque o meio se for observado excesso de evaporação ou meio descolorido devido ao desequilíbrio do pH.