Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Ressecção guiada por fluorescência e implantação de andaime
NOTA: Esterilize todas as ferramentas antes de iniciar a cirurgia.
- Coloque a estrutura estereotáxica no palco de um estereomicroscópio de dissecação de fluorescência.
- Anestesiar o camundongo sob isoflurano inalado em uma câmara de indução. Uma vez anestesiado, prenda o mouse na estrutura estereotáxica com suprimento contínuo de anestesia inalada por meio de um adaptador de cone nasal de isoflurano. Mantenha a temperatura corporal com uma almofada de aquecimento e/ou sonda.
NOTA: 4–5% de isoflurano é adequado para indução e 2–3% é adequado para manutenção, mas isso deve ser adaptado e monitorado para cada camundongo.
- Aplique pomada oftálmica nos olhos para evitar o ressecamento da córnea. Esterilize o local da incisão do couro cabeludo com uma série de três lenços umedecidos com álcool e três betadinas.
- Realize o teste de reflexo de pinça do dedo do pé em cada membro e confirme a resposta negativa para garantir a anestesia adequada. Garanta uma frequência respiratória constante em aproximadamente 55–65 respirações/min.
- Usando uma pinça, aperte e levante suavemente o couro cabeludo. Faça uma incisão rostral-caudal linear na linha média com tesoura cirúrgica. Irrigue o local da incisão com PBS e remova a gordura subdérmica com um aplicador de ponta de algodão em um movimento circular de escovação. Disponha a pele de forma que a janela craniana previamente estabelecida seja totalmente visível.
- Perfure suavemente a dura-máter logo no interior das bordas da janela craniana usando uma agulha 18G. Repita até que a incisão trace totalmente o interior da janela.
- Remova a dura-máter retirando-a com uma pinça fina, revelando o parênquima e o tumor subjacentes.
- Localize o tumor U87 mCh-Fl desligando as luzes da sala e ligando o modo de fluorescência do estereomicroscópio. Prepare-se para a ressecção carregando uma ponta de pipeta de 1 a 200 μL na extremidade da tubulação de uma bomba de vácuo.
- Ligue a bomba de vácuo. Ressecção o tumor aspirando suavemente o tecido fluorescente até que não haja mais sinal. Desligue a bomba de vácuo e descarte a ponta da pipeta. Desligue a fluorescência e as luzes do quarto voltem a acender.
NOTA: Para controlar o sangramento, irrigue com PBS frio e aplique pressão constante com um aplicador de ponta de algodão. Em casos mais graves, a cavidade de ressecção também pode ser temporariamente preenchida com um agente hemostático, desde que seja removida após a interrupção do sangramento, seguida de outra irrigação por PBS.
- Imediatamente antes da implantação, mergulhe lentamente um andaime de PLA semeado por MSC em PBS para remover meios indesejados e componentes associados. Implante o andaime na cavidade de ressecção. Se necessário, adicione 1 μL de fibrinogênio (67–106 mg/mL) seguido de 1 μL de trombina (400–625 U/mL) para fixar o andaime no lugar.
- Com a dura-máter removida e o retalho ósseo da janela craniana já descartado, sele a ferida simplesmente fechando a pele e aplicando cola cirúrgica. Retire o animal do anestésico inalado e deixe recuperar sobre uma superfície aquecida.
