Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Rotulagem de células de glioblastoma com construção FP635 ou FP720
- Produza e purifique o lentivírus de acordo com o protocolo descrito abaixo:
- Observe os pratos semeados no Dia 1. Quando as células são 80–90% confluentes, elas estão prontas para a transfecção.
NOTA: As células ainda devem ter espaço para sofrer 1–2 divisões celulares
- Preparar a mistura de plasmídeos alíquota dos quatro plasmídeos num tubo de 50 ml. Para uma preparação de prato de 12 × 15 cm, use 270 μg de vetor de transferência, 176 μg de pMDL (Gag / Pol), 95 μg de pVSVG (glicoproteína do vírus da estomatite vesicular) e 68 μg de pREV.
- Prepare 13,5 mL de CaCl 0,25M2 (diluir com ddH2O filtrado) e adicione à mistura de plasmídeo. Adicione 13,5 mL de solução 2× BBS. Misture delicadamente invertendo várias vezes e incube 15 min em temperatura ambiente (22–26°).
- Adicione a mistura de transfecção (espalhando em gotas) a cada placa (2,25 mL por placa). Agite as placas suavemente e incube a 3% de CO2, 37 ° C durante a noite (16–20 h).
- Observe as células. Eles devem estar alcançando a confluência. Se um marcador visível (como GFP) estiver presente no plasmídeo lentivetor, a eficiência da transfecção pode ser avaliada visualmente. Idealmente, a eficiência da transfecção deve ser de >90%.
- Remova o meio, adicione 15 mL de DMEM fresco + 2% de FBS a cada prato e transfira para 10% de CO2, 37 ° C. Incube durante a noite.
- Colete a primeira colheita de sobrenadante: Colete e agrupe o sobrenadante (12 pratos × 15 ml / prato = 180 mL) dos pratos.
- Adicione 15 mL de DMEM fresco + 2% de FBS a cada prato. Incube os pratos a 10% de CO2, 37 °C durante a noite. O recipiente que contém o sobrenadante lentiviral deve ser colocado numa contenção secundária (um saco de plástico selado serve) e armazenado a 4 °C.
- Concentre a preparação viral: Concentre as partículas virais por ultracentrifugação. Centrifugue o sobrenadante a 70.000 x g por 2 h a 20 °C. Tubos cônicos (em oposição aos tubos de fundo redondo) e rotores de caçamba oscilante (em oposição aos rotores de ângulo fixo) são recomendados (simplesmente porque essa combinação torna o pellet quase invisível mais fácil de localizar). Usamos tubos cônicos com rotor Beckman SW28 (capacidade para seis tubos) a 19.400 rpm por 2 h a 20 °C. Encha os tubos com 30 mL de sobrenadante. O volume total de sobrenadante de uma preparação de pratos de 12 × 15 cm é de 360 mL; portanto, o processamento do volume total exigirá duas rodadas consecutivas. Carregue os tubos, faça a primeira centrifugação, despeje o sobrenadante sem perturbar o pellet, recarregue com sobrenadante viral fresco e faça a segunda centrifugação.
- Despeje o sobrenadante e deixe o líquido restante escorrer, apoiando os tubos invertidos em toalhas de papel. Retire as gotículas restantes usando um aspirador para remover todo o líquido do pellet. O pellet deve ser pouco visível como um pequeno ponto translúcido.
- Ressuspenda os pellets virais em 100 μL de 1× HBSS. Evite espuma. Enxágue os tubos com 100 μL de 1× HBSS. Agrupe ambos os volumes para obter um volume final de 200 μL.
- Transfira para um tubo de microfífuga com tampa de rosca, embrulhe em parafilme e vórtice em velocidade baixa por 15–30 min. A preparação viral ressuspensa parecerá clara a ligeiramente leitosa.
- Limpe a suspensão girando por 10 s em uma microcentrífuga de mesa. Transfira o sobrenadante para um novo tubo de microfuga com tampa de rosca. Faça alíquotas de 20 μL do sobrenadante. Este sobrenadante viral é de qualidade in vitro.
- Cultura de aproximadamente 2,0 x 106 células de uma linhagem de glioma humano com DMEM mais 10% de soro fetal bovino (FBS) em uma placa de 15 cm; ou cultura de 2,0 x 106 esferas derivadas de pacientes com glioblastoma humano (GBM-PDX) com meio DMEM/F12 1:1 com suplemento B27 mais fator de crescimento epidérmico recombinante humano (EGF; 20 ng/mL) e FGF (10 ng/mL) em um frasco T75.
- Mantenha todas as células a 37 °C, 5% de CO2 e 100% de umidade relativa.
- Dissocie as células.
- Para as células do glioma: remova o sobrenadante das placas e adicione 3-5 mL de tripsina 1X às células do glioma.
- Para as esferas GBM: colete as células pipetando-as em um tubo de 15 mL.
- Gire as esferas GBM a 200 x g por 5 min usando uma centrífuga de mesa em temperatura ambiente.
- Remova o sobrenadante e adicione 3-5 mL de solução de descolamento celular.
- Incubar todas as células a 37 °C durante 10 a 15 min.
- Dissocie cuidadosamente as células pipetando para cima e para baixo várias vezes (certifique-se de que as esferas e as células do glioma estejam completamente dissociadas) e gire para baixo a 200 x g por 5 min.
- Remova o sobrenadante e ressuspenda as células com 5 mL de meio pipetando para cima e para baixo várias vezes. Determine a viabilidade celular por exclusão de azul de tripano.
- Placa 1,0 x 106 de células-alvo em um prato de 10 cm com 5 mL de meio por pipetagem.
- Transduzir células com lentivírus expressando proteínas fluorescentes na multiplicidade de infecção (MOI) 5 e incubar a 37 ° C.
- Após 24 h, remova o meio das células transduzidas, adicione 5 mL de meio fresco e incube por mais 48 h a 37 ° C.
- Dissocie as células infectadas em uma suspensão unicelular usando tripsina, conforme descrito acima. Gire as células a 200 x g por 5 min e ressuspenda em 500 μL de solução de classificação (solução salina tamponada com fosfato (PBS) com 1% de FBS).
- Pipetar a suspensão celular em tubos FACS. Co-corar as células com 1 μL / mL de dicloridrato de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para excluir células mortas. São necessários controlos negativos para a instalação das portas do citómetro de fluxo (células não transduzidas e células não transduzidas/coradas com DAPI).
- Classificar as células fluorescentes positivas/DAPI negativas numa solução de classificação e recolher as células classificadas num tubo cónico de 15 ml.
- Gire as células classificadas a 200 x g por 5 min, remova o sobrenadante e ressuspenda em 5 mL de meio de cultura. Semeie as células classificadas em um prato de 10 cm pipetando. Incubar a 37 °C durante pelo menos 48–72 h.
- Expanda as células classificadas dissociando-as conforme descrito acima e colocando-as em vários pratos para experimentos in vivo.
