Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1.FMT Imaging
NOTA: De acordo com o objetivo experimental, as células de glioblastoma marcadas com iRFP podem ser monitoradas in vivo antes, durante ou após o tratamento. Para fins de imagem, anestesiar os animais usando uma câmara de indução de isoflurano, mantê-los em um de imagem durante a varredura e obter imagens na estação de acoplamento do gerador de imagens FMT.
- Retire o animal da gaiola e coloque na câmara de indução de isoflurano. Feche a câmara e ligue o fluxo de oxigênio e o vaporizador para 3–5%.
- Monitore o animal até que esteja completamente anestesiado, geralmente dentro de 1 a 2 minutos. Animais inconscientes não devem responder a estímulos externos.
- Remova o animal anestesiado da câmara e coloque o animal no de imagem, colocando primeiro o adaptador de cabeça e, em seguida, colocando o animal voltado para baixo. Certifique-se de que a cabeça esteja localizada no centro do.
- Coloque a placa superior do na parte superior e aperte os botões de ajuste até 17 mm.
- Assim que o animal estiver seguro no de imagem, prossiga para a imagem inserindo o na estação de acoplamento interna do gerador de imagens FMT, onde o isoflurano é bombeado para manter o animal anestesiado.
- Execute o software do gerador de imagens e do analisador clicando duas vezes no ícone do software.
- Na janela "Aba Experimental", selecione "Banco de dados" e "Grupo de estudo".
- Vá para a janela "Guia Digitalizar" e selecione o assunto para a imagem clicando em "selecionar assunto". Além disso, selecione o canal do laser no painel "Canal do laser". Para as células marcadas com FP635, selecione "canal de laser 635 nm" e, para células marcadas com FP720, selecione "canal de laser 680 nm".
- Adquira uma imagem clicando na opção "Capturar" na janela "Guia Digitalizar". Em seguida, ajuste o campo de digitalização clicando e arrastando o campo de digitalização na imagem capturada para um determinado número de locais de origem, geralmente dentro de 20 a 25 fontes para o lado ipsilateral.
- Marque a opção "Adicionar à fila de reconstrução" e clique em "Scan" na janela "Scan tab".
- Aguarde até que a digitalização seja concluída e, em seguida, remova o de imagem da docking station.
- Remova a placa superior do e coloque o animal de volta na gaiola.
- Repita as etapas 1.1 a 1.12 para o resto dos animais.
2. Análise de imagem
- No software de geração de imagens e analisadores, selecione a janela "Guia Análise".
- Carregue o conjunto de dados e o assunto a ser analisado clicando no botão "+" no painel "Seleção do conjunto de dados" da janela "Guia Análise".
- Depois que a imagem for carregada na janela da guia "Análise", execute a análise da região de interesse (ROI) selecionando o ícone de elipsóide, localizado no canto superior esquerdo da janela da guia "Análise".
- Ajuste o limite para zero no painel "dados estatísticos" clicando com o botão direito do mouse na coluna "limite" na janela da guia "Análise".
- O valor total no painel "Dados estatísticos" representa o sinal das células de glioblastoma marcadas com fluorescência implantadas no cérebro do camundongo.
- Repita as etapas 2.2–2.4 para o resto dos animais. Carregue ou remova um novo assunto clicando no botão "+" ou "-", respectivamente, no painel "Seleção do conjunto de dados" da janela da guia "Análise".
