Ensaio de migração de células-tronco tumorais cerebrais (BTSC) para estudos de tratamento medicamentoso: uma técnica de imagem de células vivas in vitro para analisar o efeito do tratamento medicamentoso na migração de BTSCs

Resumo

Fonte: Restall, I. et al. Ensaios de imagem de células vivas para estudar glioblastoma, tumor cerebral, migração e invasão de células-tronco. J. Vis. Exp. (2018)

Neste vídeo, realizamos um ensaio de migração de células-tronco tumorais cerebrais para analisar o efeito da droga de interesse na migração de células-tronco tumorais cerebrais vivas usando placa de migração de quimiotaxia. A imagem de células vivas facilita a visualização e quantificação da migração celular durante o ensaio.

Protocolo

1. Ensaio de migração de células-tronco de tumor cerebral

1. Semeie 200.000 células em um frasco T25 em 8 mL de meio completo 1–2 semanas antes de planejar a realização de um ensaio de migração.
   nota: O tempo entre o plaqueamento e a realização do ensaio varia de acordo com a taxa de crescimento da cultura BTSC usada.
   1. Para testar o efeito de um tratamento medicamentoso na migração, pré-trate as células com o veículo apropriado, como DMSO, e o medicamento de interesse, adicionando volumes aplicáveis do veículo ou estoque de medicamentos diretamente em poços separados de meio contendo as células.
2. Preparar a placa de migração quimiotaxia (figura 1A) revestindo-a com uma fina camada de colagénio.
   1. Calcule o número de poços de uma placa de quimiotaxia de 96 poços que precisará ser revestida com colágeno. Inclua pelo menos três poços replicados para cada condição.
   2. Diluir 5 mg/mL de estoque de colágeno tipo I a 0,2 mg/mL em ácido acético puro diluído a 0,14% em água de grau de cultura.
   3. Pipetar 0,2 mg/mL de colágeno para os poços de inserção da membrana e para os poços do reservatório inferior que estão sendo usados.
      nota: Os reservatórios inferiores da placa requerem 225 μL e os poços de inserção da membrana requerem 75 μL de colágeno para um revestimento adequado.
   4. Colocar a placa de migração numa incubadora a 37 °C durante 1 h. Aspirar a solução de colagénio dos alvéolos sem riscar o revestimento de colagénio.
   5. Lave os poços 2x com 1x PBS estéril. Se a placa não estiver sendo usada imediatamente, aspire o PBS e armazene-o a 4 ° C por até 2 semanas. Antes de usar, aqueça a placa de migração de quimiotaxia à temperatura ambiente.
3. Preparar o reservatório inferior da placa de migração da quimiotaxia.
   1. Pipetar 225 μL de meio (sem fatores de crescimento), suplementado com 10% de FBS como quimioatraente, para os poços do reservatório inferior da placa de migração de quimiotaxia.
   2. Coloque suavemente a inserção da membrana no reservatório inferior em um ângulo para evitar a criação de bolhas.
4. Colocar as células na inserção da membrana da placa de migração da quimiotaxia.
   1. Ressuspenda BTSCs dissociadas em meio (sem fatores de crescimento) a uma densidade celular de 50.000 células / mL. Adicione medicamentos à mídia se estiver avaliando a migração durante diferentes tratamentos medicamentosos. Como alternativa, semeie o mesmo número de células pré-tratadas e células de controle, mantendo a concentração final do medicamento durante o plaqueamento.
   2. Colocar 50 μL das BTSCs da etapa 1.4.1 em cada poço da placa de migração nas condições de tratamento desejadas.
5. Imagine a migração da quimiotaxia.
   1. Coloque a placa de migração de quimiotaxia no sistema de imagem de células vivas e configure o software de imagem automatizado para adquirir imagens microscópicas da placa a cada 1–2 h por até 72 h. Usando um software comercial (consulte a Tabela de Materiais), clique com o botão direito do mouse na linha do tempo e defina o intervalo de varredura para a cada 2 h por 24 h.
      nota: O intervalo de tempo e o tempo total decorrido variam entre as culturas BTSC utilizadas; começar com intervalos de 2 h durante 72 h até adquirir experiência com culturas BTSC individuais. Se um sistema de imagem automatizado não estiver disponível, as imagens do mesmo campo de visão podem ser adquiridas manualmente com um microscópio e uma câmera conectada ao software de imagem.
   2. Uma vez concluída a aquisição da imagem, obtenha as imagens para todo o experimento e crie uma definição de processamento usando o software de análise que diferencia as células do fundo da membrana e dos poros de migração (Figura 1B, máscara vermelha). Usando software comercial (consulte a Tabela de Materiais), selecione uma Nova Definição de Processamento e defina as configurações de definição de processamento para BTSCs para um limite de semente de 52, um limite de crescimento de 85, ajustes do tamanho (pixels) em -1 e uma área mínima de 200 μm². Aplique esta definição de processamento na parte inferior da membrana. Modifique essa análise se ela não distinguir com precisão as células da membrana de fundo.
   3. Colete dados como a área da superfície celular na parte inferior da membrana para cada um dos três poços replicados, que conta apenas as células que migraram pelos poros. Representar graficamente a migração das células em μm² (área de células migradas) ao longo do tempo (Figura 1C).
      nota: Certifique-se de que o número relativo de células plaqueadas e contadas na superfície superior da membrana no primeiro ponto de tempo seja semelhante (menos de 20% de variação em todos os poços) entre todas as condições de tratamento para evitar quaisquer efeitos de plaqueamento irregular. A coleta de dados usando o software comercial (consulte Tabela de Materiais) pode ser executada iniciando a definição de processamento criada na etapa 1.5.2, clicando em Métricas, depois em Gráfico/exportação e depois em Exportação de dados.

Resultados

Figura 1: Imagem de células vivas de uma migração BTSC. (A) Este é um exemplo de uma placa de migração de quimiotaxia de 96 poços revestida com uma fina camada de colágeno tipo I antes de realizar o ensaio de migração com BTSCs. As imagens mostram i) uma placa com todas as três partes (tampa, inserção de membrana e reservatório) colocadas juntas, ii) todas as três pa...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Matriz de matrigel	Corning	Rolamento 356230
Placas de 96 poços	Eppendorf	30730119
T25 Nunc EasYFlask	ThermoFisher	156367
Tubo cônico Falcon 15 mL	ThermoFisher	352096
Placa de quimiotaxia de 96 poços Incucyte ClearView	Biociência de Essen	Nº 4582
Sistema de análise de células vivas IncuCyte Zoom	Biociência de Essen	Nº 4545
Software de análise de células vivas IncuCyte Zoom	Biociência de Essen	2016A Rev1
Solução salina tamponada com fosfato (PBS)	sigma	D8537
Água de grau de cultura	Lonza BioWhittaker	17-724Q
Soro fetal bovino (FBS)	Invitrogen	Rolamento 12483-020
Colágeno de rato I	Trevigen	3440-100-01
Solução de descolamento de células Accumax	Tecnologias Celulares Inovadoras	AM105