1. Ensaio de invasão da neuroesfera de células-tronco de tumor cerebral
- Semeie 200.000 células em 8 mL de meio completo em um frasco T25 1–2 semanas antes de planejar a realização de um ensaio de invasão.
nota: O tempo desde o plaqueamento até a realização do ensaio dependerá da taxa de proliferação da cultura BTSC usada.
- Para células pré-tratadas, adicione o composto de interesse ao frasco na concentração desejada para o curso de tempo predeterminado antes que as neuroesferas estejam prontas para serem plaqueadas para invasão.
- Aguarde até que o tamanho médio da neuroesfera seja de aproximadamente 150 a 200 μm; normalmente, isso leva de 7 a 14 dias, dependendo da cultura BTSC que está sendo usada.
nota: É típico observar uma distribuição de tamanhos de esferas no frasco.
- Incline e misture suavemente o frasco com uma pipeta e mova 500 μL das neuroesferas BTSC para um tubo cônico de 1,5 mL para cada condição de tratamento; isso será usado para plaquear três poços replicados.
NOTA: As etapas 1.3.1 a 1.3.2 são opcionais, mas recomendadas para o primeiro experimento de invasão em uma nova cultura BTSC.
- Para determinar a densidade das neuroesferas que acabarão no poço, prepare um tubo de 1,5 mL como na etapa 1.3. Misture suavemente as neuroesferas e mova 100 μL para uma placa separada de 96 poços e deixe as neuroesferas assentarem por gravidade por 5 min.
- Verifique o número de neuroesferas sob o microscópio para garantir que várias neuroesferas estejam na região do poço que será fotografado sem superlotá-lo.
nota: As neuroesferas invasoras requerem espaço suficiente para triplicar de diâmetro sem interagir com as neuroesferas vizinhas. O número de neuroesferas por poço pode ser ajustado contando o número de neuroesferas por poço e adicionando mais ou menos neuroesferas do frasco T25 ao tubo cônico de 1,5 mL na etapa 1.3.
- Coloque o tubo cônico de 1,5 mL com as células da etapa 1.3 no gelo e execute as etapas 1,5 a 1,7 no gelo.
- Deixe as neuroesferas assentarem por gravidade no fundo do tubo cônico de 1,5 mL por 5 min e coloque uma placa de 96 poços marcada no gelo.
- Ressuspenda as neuroesferas na proteína da matriz extracelular.
- Prepare 500 μL de uma solução de colágeno tipo I 0,4 mg/mL em gelo para cada condição de tratamento: adicione 459 μL de meio (sem fatores de crescimento), 40 μL da solução estoque de colágeno 5 mg/mL e 0,92 μL de NaOH 1N estéril (Tabela 1).
NOTA: São necessários 500 μL da solução de colágeno por condição de tratamento: 100 μL para cada um dos três poços replicados e 200 μL de excesso. Os tratamentos medicamentosos precisam ser adicionados aqui na concentração final desejada, subtraída do componente de meio da solução. Este protocolo descreve o uso do colágeno tipo I como proteína da matriz extracelular; no entanto, qualquer proteína da matriz extracelular pode ser testada. Além disso, para culturas BTSC que têm taxas de invasão mais lentas, fatores de crescimento ou FBS podem ser suplementados na mídia para aumentar a taxa de invasão.
- Depois que as neuroesferas da etapa 1.5 se assentarem, aspire o máximo possível do meio sem perder o pellet da neuroesfera que se depositou no fundo. Ressuspenda suavemente as neuroesferas em 500 μL da solução de colágeno preparada na etapa 1.6.1.
- Adicione 100 μL da mistura de colágeno e neuroesfera a três poços replicados da placa de 96 poços em gelo. Deixe as neuroesferas assentarem no gelo por 5 min.
- Transfira a placa de 96 poços para uma incubadora de 37 °C por 5 min para permitir a polimerização do colágeno.
- Prepare-se imediatamente para obter imagens da placa de 96 poços.
- Coloque a placa de 96 poços na bandeja de um sistema de imagem de células vivas ou no palco de um microscópio para adquirir uma imagem como referência para o tamanho da neuroesfera no momento do revestimento, antes do início da invasão.
- Adquira imagens a cada hora até que a taxa de invasão se estabilize; normalmente, isso ocorre dentro de 24 h.
nota: O intervalo de imagem pode ser modificado dependendo do equipamento que está sendo usado. O intervalo de imagem e o tempo total decorrido também podem ser modificados para culturas BTSC que apresentam diferentes taxas de invasão.
- Determine a área de superfície crescente das BTSCs à medida que elas invadem a matriz ao longo do tempo.
nota: A área de superfície das células no momento do plaqueamento, calculada como a média de três poços replicados, precisa ser semelhante (menos de 20% de variação em todos os poços) entre as diferentes condições de tratamento para garantir que as diferenças na invasão do BTSC não sejam fortemente afetadas pelo número ou tamanho das neuroesferas plaqueadas.
- Para o sistema de análise de células vivas, use uma objetiva de 10X para a aquisição de imagens e adquira quatro imagens por poço para os três poços replicados. Para determinar a área relativa da superfície celular, representada como a porcentagem de confluência do poço, configure uma definição de processamento que destaque especificamente as células sobre o fundo do poço. Usando software comercial (consulte Tabela de materiais), selecione uma Nova definição de processamento e defina o ajuste de segmentação para 0,8, a área mínima para 300 μm2 e a excentricidade máxima para 0,99. Modifique essa análise se ela não distinguir com precisão as células do plano de fundo.
nota: Se estiver usando outros métodos para obter imagens da invasão da neuroesfera ao longo do tempo, recomenda-se obter vários campos de visão para os três poços replicados ao longo do tempo. No entanto, não criar imagens exatamente do mesmo campo de visão em cada intervalo aumentará o erro padrão dos dados coletados. O software de computador pode ser usado para ajudar a medir a área de superfície das células invasoras em cada imagem.
- Colete dados como a área total da superfície celular (relativa ou absoluta) para cada poço em cada ponto de tempo e determine a média dos três poços replicados. Faça um gráfico da invasão de BTSCs traçando o aumento da área celular ao longo do tempo.
| Preparação da solução de colágeno |
| Estoque [Colágeno] (mg/mL) | 5 |
| Final [Colágeno] (mg/mL) | 0,4 |
| Número de poços necessários: | 5 |
| Volume total (μL) | 500 |
| Volume de colágeno estoque (μL) | 40 |
| Volume de NaOH 1N (μL) | 0,92 |
| Volume de mídia (μL) | 459 |
Tabela 1: Preparação da solução de colágeno tipo I 0,4 mg/mL. Listadas estão as concentrações iniciais conhecidas e finais desejadas da solução de colágeno tipo I. Os volumes listados são suficientes para colocar as neuroesferas em três poços replicados, mais dois para excesso, e podem incluir uma única condição de tratamento, conforme descrito em detalhes na etapa 1 do protocolo.
