Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação dos slides padronizados
- Preparação de substrato para micropadronização
- Trate lamínulas de vidro circulares de 18 mm por ativação de ar/plasma por 5 min. Coloque as lamínulas em uma câmara fechada com 100 μL de (3-aminopropil) trietoxissilano em um dessecador por 1 h.
- Incubar com 100 mg/mL de valerato de poli (etilenoglicol)-succinimidil (peso molecular 5.000 (Peg-SVA)) em tampão carbonato 10 mM, pH > 8, por 1 h. Enxágüe extensivamente com água ultrapura e seque sob uma capa química.
nota: Nesta fase, a amostra pode ser armazenada a 4°C no escuro para uso posterior.
- Adicione o fotoiniciador, cloreto de 4-benzoilbenzoil-trimetilamônio (PLPP), a 14,7 mg/mL em solução salina tamponada com fosfato (PBS).
nota: Uma forma concentrada de PLPP, um gel PLPP, também pode ser usada. Isso resulta em um tempo de iluminação ultravioleta (UV) mais curto necessário para degradar a escova PEG (100 mJ/mm2).
- Deposição de gel fotoiniciador
- Prepare uma mistura de 3 μL de gel PLPP e 50 μL de etanol absoluto para depositar no centro da lâmina. Colocar a amostra sob uma coifa química até a evaporação completa do etanol absoluto.
nota: Nesta fase, a amostra pode ser armazenada a 4°C no escuro para uso posterior.
- Micropadronização de slides de vidro
- Monte a lamínula em uma câmara Ludin e coloque-a no estágio motorizado de um microscópio equipado com um sistema de foco automático.
- Carregue imagens correspondentes aos micropadrões previstos no software. Aplicar estes parâmetros: replicação 4 x 4 vezes, espaçamento de 200μm, dose UV de 1.000 mJ/mm2. Após a sequência automática de iluminação UV, enxágue o PLPP com várias lavagens PBS.
nota: Se o gel PLPP foi usado, remova-o por lavagens extensivas com água deionizada, seque em uma corrente de N2 e armazene a 4 ° C.
- Incubar com laminina (50 μg/mL em PBS) por 30 min. Lavar extensivamente com PBS.
NOTA: Uma solução fluorescente de proteína fluorescente verde purificada (GFP, 10 μg / mL em PBS) pode ser misturada com laminina para visualizar os micropadrões por microscopia de fluorescência.
2. Preparação de neurônios e células GBM para co-cultura
- Cultura de neurônios embrionários do hipocampo de ratos
- Dissecar o hipocampo de ratos embrionários (E18) e transferir o tecido para uma solução salina balanceada de Hank (HBSS) / 1 mM de ácido 4-(2-hidroxietil) -1-piperazineetanossulfônico (HEPES) / solução de penicilina-estreptomicina em um tubo de 15 mL. Remova o excesso de solução sem secar o hipocampo.
- Adicione 5 mL de tripsina-etilenodiamina ácido tetraacético (EDTA) suplementado com penicilina (10.000 unidades/mL)/estreptomicina (10.000 μg/mL) e 1 mM de HEPES e incube por 15 min a 37 °C. Lave 2x com a solução de HBSS/HEPES/penicilina-estreptomicina e deixe o tecido permanecer nesta solução por 2–3 min.
- Dissocie o tecido usando duas pipetas Pasteur polidas com chama, pipetando para cima e para baixo 10x com cada tecido, tomando cuidado para minimizar a formação de espuma. Conte as células e avalie a viabilidade da suspensão celular. Coloque os neurônios em lamínulas micropadronizadas conforme indicado abaixo.
nota: A taxa de viabilidade celular é de 85 a 90% após a extração.
- Cultura de células para neurônios em lamínulas micropadronizadas
- Reidrate lâminas de vidro micropadronizadas com PBS e incube o meio de cultura de células neuronais completo.
- Semeie os neurônios do hipocampo obtidos de ratos E18 Sprague-Dawley diretamente sobre a lamínula de vidro micropadronizada a uma densidade de 50.000 células por cm2 em meio neurobasal (NBM) enriquecido com 3% de soro de cavalo. Coloque os neurônios micropadronizados na incubadora (37 ° C, 5% CO2) por 48 h.
nota: Após ~ 6 h, os neurônios primários do hipocampo podem ser vistos aderindo aos micropadrões da laminina.
- Co-cultura de células-tronco humanas GBM em neurônios
- À medida que as células em forma de esferóide crescem em suspensão, centrifugue a suspensão por 5 min a 200 × g. Lave os esferóides com 5 mL de PBS e incube as células com 0,5 mL do reagente de dissociação celular (consulte a Tabela de Materiais) por 5 min a 37 ° C.
- Adicione 4,5 mL de NBM completo (complementado com suplemento de B27, heparina, fator de crescimento de fibroblastos 2, penicilina e estreptomicina, conforme descrito anteriormente) e conte as células usando uma técnica de contagem automática.
- Semeie 1.000 células GBM sobre a cultura neuronal micropadronizada em NBM enriquecida com 3% de soro de cavalo. Incubar a placa a 37 °C, 5% de CO2 e 95% de humidade.
