Isolamento e Cultura de Pericitos Cerebrais Primários: Um Procedimento para Isolar e Cultivar Pericitos de Capilares Cerebrais Bovinos Sem Contaminação de Células Endoteliais

Resumo

Fonte: Hørlyck, S. et al. Cultura de pericitos capilares cerebrais para medições citosólicas de cálcio e estudos de imagem de cálcio.J. Vis. Exp. (2020)

Neste vídeo, demonstramos o procedimento para isolar e cultivar pericitos de capilares cerebrais bovinos sem contaminação de células endoteliais.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Semeadura e cultura de capilares bovinos

1. Dia 0: Misture 0,7 mL de estoque de colágeno IV com 6,3 mL de PBS. Adicionar a solução a um balão T75 e deixar o balão durante 2 h à temperatura ambiente (RT) ou deixá-lo durante a noite a 4 °C.
2. Remova a solução de colágeno do frasco e lave três vezes com PBS.
3. Adicionar 7 ml de solução de trabalho de fibronectina e deixar o balão durante 30 min à RT. Em seguida, remova a solução de fibronectina e semeie os capilares imediatamente depois.
4. Durante o tempo de espera de 30 minutos, descongele um frasco de capilares em banho-maria a 37 °C.
5. Quando os capilares estiverem descongelados, transfira imediatamente para um tubo de centrifugação com 30 mL de DMEM-comp e centrifugue por 5 min a 500 x g e RT. Remova o DMEM-comp do tubo e ressuspenda o pellet capilar em 10 mL de DMEM-comp fresco.
6. Transfira a suspensão de 10 ml para o balão T75 revestido e deixe os capilares aderirem ao fundo do balão durante 4–6 h numa incubadora a 37 °C a 10% CO₂.
   nota: A taxa de crescimento celular é maior a 10% de CO₂ em vez dos convencionais 5% de CO₂.
7. Após 4–6 h de incubação, inspecionar o frasco sob um microscópio óptico. As fracções de capilares devem agora ser fixadas no fundo do balão (figura 1, dia 0).
8. Prepare o GM e aspire o meio DMEN-comp com muito cuidado dos capilares e substitua-o por 10 mL de GM recém-feito.
9. Dia 2: Remova o GM dos capilares e substitua por 10 mL de GM recém-feito. O crescimento celular dos capilares deve ser visível sob um microscópio óptico neste momento (Figura 1, dia 2–3).

2. Isolamento de pericitos primários de capilares cerebrais bovinos

1. Dia 4: Inspecione os capilares sob um microscópio óptico.
   nota: O frasco deve agora ser aproximadamente 60-70% confluente para fornecer uma quantidade adequada de pericitos (Figura 1, dia 4). Se não for esse o caso; substitua o GM por 10 ml de meio fresco e deixe o balão na incubadora por mais um dia.
2. Aspire o meio e lave as células suavemente em PBS.
3. Adicione 2 mL de tripsina-EDTA descongelada para células endoteliais e deixe o frasco na incubadora por 1–3 min. Retire o frasco com freqüência e observe com o microscópio durante esse período.
   nota: As células endoteliais devem arredondar e se desprender do frasco; Os pericitos devem ser visíveis como células com uma morfologia "fantasma" e ainda estar ligados à superfície do frasco. Este é um passo complicado e importante.É essencial remover a maioria das células endoteliais para evitar a contaminação da monocultura de pericitos, mas a tripsinização prolongada também pode desprender os pericitos. O tempo de tripsinização pode variar ligeiramente de tempos em tempos, sendo, portanto, de extrema importância observar o frasco frequentemente com o microscópio durante o tratamento.
4. Bata suavemente no frasco, quando as células endoteliais começarem a arredondar, para separar as células endoteliais soltas.
5. Para interromper a tripsinização, adicione 10 mL de DMEM-comp ao frasco. Lave o frasco cuidadosamente algumas vezes com o meio para remover as células endoteliais. Aspirar a suspensão de células endoteliais do balão. As células endoteliais agora podem ser usadas para outros fins.
6. Adicionar 10 ml de DMEM-comp ao balão. Olhe sob o microscópio óptico para garantir que os pericitos ainda estejam presentes e presos ao fundo. Coloque o frasco de volta na incubadora para permitir que a cultura enriquecida com pericito cresça.
   nota: É importante observar a cultura durante os dias seguintes. Se ainda houver um bom número de células endoteliais em crescimento, outro tratamento com tripsina pode ser realizado.
7. Permitir que a monocultura de pericitos cresça com a mudança de DMEM-comp. meio a cada dois dias. Verifique o crescimento das células ao microscópio óptico (Figura 1, dia 5–8).

Resultados

Figura 1: Cultura de capilares e isolamento de pericitos.Os capilares foram isolados do cérebro bovino fresco e semeados em frascos de cultura no dia 0. O crescimento dos capilares cerebrais bovinos e o seguinte isolamento de pericitos foram acompanhados ao longo de dias com um microscópio óptico. O dia 4a mostra o crescimento das células endoteliais antes do tratamento com tripsina para remover as c...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pbs	Sigma Aldrich	D8537	Solução salina tamponada com fosfato
Colágeno IV	Sigma Aldrich	C5533
Balão T-75	Sigma Aldrich	CLS3972
Soro fetal bovino (FBS)	PAA/GE Saúde	A15-101
Fibronectina	Sigma Aldrich	F1141
Tripsina-EDTA	Sigma Aldrich	T4299
Microscópio óptico	Olimpo	Olympus CK2	Microscópio de luz vertical com contraste de fase
Dmso	Sigma Aldrich	471267
heparina	Sigma Aldrich	H3149
Incubadora de células	Thermo Fisher
centrifuga	Thermo Fisher	Heraeus Multifuge 3SR+	Centrífuga padrão de grande volume para girar células
Águias Modificadas de Dulbecco Médio	Sigma Aldrich	D0819
Penicilina G Sódica/Sulfato de Estreptomicina	Sigma Aldrich	Pág. 0781
Aminoácidos não essenciais MEM	Sigma Aldrich	M7145