Isolamento de capilares cerebrais do cérebro humano: um método otimizado para extrair capilares cerebrais do tecido cerebral humano

Resumo

Fonte: Hartz, A. M. S. et al. Isolamento de capilares cerebrais de tecido cerebral humano fresco. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo apresenta o isolamento dos capilares cerebrais de um tecido cerebral humano fresco. Os capilares isolados podem então ser usados para gerar um modelo de barreira hematoencefálica ex vivo.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

1. Preparação de amostras cerebrais

NOTA: A Figura 1A mostra o gráfico de fluxo de trabalho de todo o procedimento de isolamento descrito abaixo. O tecido cerebral humano pode se originar de qualquer parte do córtex e pode ser usado fresco ou congelado. O tecido cerebral congelado pode ser descongelado à temperatura ambiente (sem tampão; ~ 30 min para 10 g). Para obter resultados comparáveis, o tecido cerebral deve ser obtido da mesma região do cérebro para cada experimento. Este protocolo é otimizado para córtex cerebral humano fresco (intervalo post-mortem ou PMI <4 h) que não foi congelado.

1. Preparação do tecido cerebral humano: Documente o peso do tecido cerebral. Todos os números no protocolo a seguir são apropriados para 10 g de tecido cerebral humano fresco. Coloque o tecido cerebral em uma placa de Petri de 100 mm. Remova cuidadosamente todas as meninges com uma pinça. Use um bisturi para cortar a substância branca.
2. Picagem do tecido cerebral humano: Corte cuidadosamente o tecido cerebral e pique-o com um bisturi. Pique por cerca de 5 min (pedaços de 2–3 mm). Transfira o tecido cerebral para o moedor de tecidos Potter-Elvehjem. Adicione 30 mL de tampão de isolamento.
   nota: Os pedaços de tecido picados são difíceis de ver, pois o tecido cerebral se transforma em mingau durante o processo de picagem.

2. Homogeneização

1. Triturador de tecidos Potter-Elvehjem (depuração: 150–230 μm): Homogeneizar cada amostra com 100 golpes a uma velocidade homogeneizadora de 50 rpm. Documente o tempo a cada 25 golpes e o tempo total necessário para 100 golpes. Consulte a Tabela 1 para obter uma proposta de protocolo de homogeneização; O tempo total para homogeneizar 10 g do córtex frontal humano é de cerca de 22 min. Não mexa no ar para evitar bolhas.
2. Homogeneizador Dounce (folga: 80–130 μm): Transfira o homogeneizado para um homogeneizador Dounce no gelo. Homogeneizar a suspensão com 20 tempos (~6 s/curso, total de ~2 min). Evite bolhas.

3. Centrifugação

1. Distribuir o homogeneizado cerebral em quatro tubos de centrifugação de 50 ml e documentar o volume total do homogeneizado. Distribua 50 mL de tampão de gradiente de densidade nos tubos de centrifugação (12,5 mL por tubo). Use 10 mL de tampão de isolamento para enxaguar o pilão e o homogeneizador e distribua nos quatro tubos de centrifugação (~ 2,5 mL por tubo).
2. Feche bem os tubos da centrífuga com tampas. Misture o homogeneizado, o meio de gradiente de densidade e tampão agitando vigorosamente os tubos. Centrifugar a 5.800 x g por 15 min a 4 °C (rotor de ângulo fixo); Selecione uma velocidade de desaceleração média para manter o pellet preso ao tubo. Descarte o sobrenadante e ressuspenda cada pellet em 2 mL de BSA a 1%.

4. Filtração

NOTA: Para separar os capilares dos glóbulos vermelhos e outros detritos celulares, são necessárias várias etapas de filtração.

1. Malha de 300 μm: Após ressuspender o pellet, filtrar a suspensão através da malha de 300 μm. Os capilares são filtrados através da malha, enquanto vasos maiores e detritos cerebrais maiores permanecem na malha. Lave cuidadosamente a tela com até 50 mL de BSA a 1%. Descarte o mesh.
   nota: Esta etapa de filtração limpa a suspensão capilar de quaisquer vasos maiores ou pedaços de detritos cerebrais.
2. Filtro de deformação celular de 30 μM
   nota: Esta etapa de filtração separa os capilares dos glóbulos vermelhos e outros detritos cerebrais.
   1. Distribuir o filtrado capilar do passo 4.1 pelos cinco filtros de estirpe celular de 30 μm (cerca de 10 ml de filtrado capilar por filtro de estirpe celular). Os capilares são retidos por este filtro, enquanto os glóbulos vermelhos, outras células individuais e pequenos detritos cerebrais passam pelo filtro e são coletados no filtrado.
   2. Lave cada filtro com 25 mL de BSA a 1%. Em seguida, despeje todos os filtrados sobre o sexto filtro para aumentar o rendimento. Lave cada filtro com 50 mL de BSA a 1%; Mantenha os filtros de tensão celular com os capilares contidos e descarte o filtrado.

5. Coleta Capilar

1. Vire os filtros de cabeça para baixo e lave os capilares com 50 mL de BSA a 1% para cada filtro em tubos de 50 mL. Aplique pressão suavemente com a ponta da pipeta de um pipetador de 5 mL e mova-o pelo filtro para lavar os capilares cerebrais.
2. Certifique-se de lavar todos os capilares cerebrais, especialmente da borda do filtro. Evite bolhas, pois isso dificulta o processo de filtração e aumenta a chance de perda capilar.

6. Lavagem

1. Após a coleta dos capilares, centrifugue todas as amostras a 1.500 x g por 3 min a 4 °C (rotor do balde oscilante). Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em aproximadamente 3 mL de tampão de isolamento. Combine todos os pellets ressuspensos de uma amostra em um tubo cônico de 15 mL e encha-o com tampão de isolamento. Centrifugue novamente a 1.500 x g por 3 min a 4 °C e lave mais duas vezes.
2. Documente a pureza capilar com um microscópio (ampliação de 100X) e câmera (Figura 1B).
   nota: O rendimento capilar cerebral de 10 g de tecido cerebral humano é geralmente de cerca de 100 mg. Os capilares cerebrais isolados agora podem ser usados para experimentos, processados (por exemplo, lisado, isolamento de membrana) ou congelados rapidamente e armazenados a -80 ° C em criotubos por um período mínimo de 6 a 12 meses (evite vários ciclos de congelamento e descongelamento).

Traços	Hora
1–25	7–7,5
26–50	5–5,5
51–75	5–5,5
76–100	5–5,5
Tempo total:	22–24 min

Tabela 1: Protocolo de homogeneização. O protocolo de homogeneização para o moedor de tecidos Potter-Elvehjem para homogeneizar 10 g de córtex frontal humano a uma velocidade de homogeneização de 50 rpm. Observe que os primeiros golpes requerem tempo adicional para homogeneizar o tecido picado. Após essa homogeneização inicial, cada golpe tem 12 s de duração (6 s para movimento descendente, 6 s para movimento ascendente). Assim, após a homogeneização inicial, 5 golpes podem ser realizados em 1 min, ou 25 golpes em 5 min.

Resultados

Figura 1: Fluxograma para isolamento capilar. (A) O pictograma ilustra as principais etapas do procedimento para isolar os capilares cerebrais do tecido humano fresco. (B) A imagem mostra capilares cerebrais humanos isolados sob um microscópio de luz diretamente após o isolamento (ampliação de 100X).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Equipamento de Proteção Individual (EPI)
Luvas de látex Diamond Grip Plus, Microflex Médio	VWR, Radnor, Pensilvânia, EUA	Rolamento 32916-636	Ppe
Jalecos de proteção descartáveis	VWR, Radnor, Pensilvânia, EUA	Rolamento 470146-214	EPI; devido à natureza do material de origem humana, recomenda-se o uso de jaleco descartável
Protetor facial, descartável	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA	19460102	EPI; devido à natureza do material de origem humana, recomenda-se o uso de um protetor facial descartável
Materiais de segurança
Sacos de autoclave de alta temperatura Clavies 8 x 12	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA	01-815-6
Papel de Bancada Versi Dry 18" x 20"	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA	14-206-32	Para cobrir áreas de trabalho
Sistemas de contentores para objetos cortantes da VWR	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA	Rolamento 75800-272	Para bisturis usados
Alvejante 8.2% Clorox Germicida 64 oz.	Centro de Suprimentos do Reino Unido, Lexington, KY, EUA	323775
Equipamento
Geladeira 4 °C	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA	13-986-148
Medidor de pH Accume BASIC AB15	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA	AB15
Controle Heidolph RZR 2102	Heidolph, Elk Grove Village, IL, EUA	Rolamento 501-21024-01-3
Centrífuga Sorvall LEGEND XTR	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA	75004521
Microscópio de dissecação Leica L2	Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, EUA		Usado para remover meninges
Homogeneizador POLYTRON PT2500	Kinematica AG, Lucerna, Suíça	9158168
Balança P-403	Denver Instrument, Bohemia, NY, EUA	191392
Mini Stir padrão	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA	1151050
Frascos Térmicos de Nitrogênio Líquido Dewar	Thermal Scientific, Mansfiled, TX, EUA	11-670-4C	Usado para congelar o tecido
Balança Analítica Voyager Pro	OHAUS, Parsippany, Nova Jérsia, EUA	VP214CN
Microcopa ZEISS Axiovert	Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, EUA		Usado para verificar capilares isolados
Ferramentas e Artigos de Vidro
Pipeta Finnpipette II 1-5 mL	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA	Rolamento 21377823T1	Lave os capilares do filtro
Pipeta Finnpipette II 100-1.000 μL	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA	Rolamento 21377821T1	Ressuspender o pellet em BSA
Menino Pipet	Integra, Hudson, NH, EUA	739658
Tubos Falcon de 50 mL 25/rack - 500/cs	VWR, Radnor, Pensilvânia, EUA	21008-951
Lâminas de bisturi EISCO	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA	S95938C	Para picar o tecido cerebral
PARAFILME	VWR, Radnor, Pensilvânia, EUA	Rolamento 52858-000	Para cobrir o béquer e o balão volumétrico
Ponteiras de Pipeta Finntip da Thermo Scientific 5 mL	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA	21-377-304	Para lavar os capilares do filtro
Seringa de 60 mL com Luer-Lok	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA	BD309653	Usado com anel conector para filtrar capilares
Cabo de bisturi # 4	Ferramentas de Belas Ciências, Foster City, CA, EUA	10060-13	Usado para picar
Fórceps Dumont #5	Ferramentas de Belas Ciências, Foster City, CA, EUA	11251-10	Usado para remover meninges
Moedor de Tecidos Potter-Elvehjem	Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, EUA	3.43E+28	Volume de 50 mL, depuração: 150-230 μm
Homogeneizador Dounce	VWR, Radnor, PA, EUA	Nº 62400-642	Volume de 15 mL, depuração: 80-130 μm
Filtros Spectra/Mesh Woven (300 μm)	Laboratórios Spectrum, Rancho Dominguez, CA, EUA	146424	Usado para filtrar a suspensão capilar para remover quaisquer meninges que possam ser deixadas
pluriFiltros (tamanho do poro: 30 μm)	pluriSelect Ciências da Vida, Leipzig, Alemanha	Telefone: 43-50030-03
Anel Conector	pluriSelect Ciências da Vida, Leipzig, Alemanha	41-50000-03	Reutilizar várias vezes
Balão volumétrico de 1 L			Para preparação do Buffer de Isolamento
Copo de 1 L			Para preparação de 1% BSA
Barra de agitação			Para preparação de 1% BSA e Ficoll®
Garrafa Schott (60 mL)			Para preparação de Ficoll®
Balde de gelo			Para manter tudo frio
Placa de Petri de 100 mm			Para picar o tecido cerebral
Raspador de células de cultura de tecidos	VWR, Radnor, Pensilvânia, EUA	Rolamento 89260-222	Para remover o sobrenadante após centrifugação
Produtos químicos
BSA Fração V, A-9647	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	A9647-500g	Prepare em DPBS com Ca2+ & Mg2+ no dia anterior. Evite bolhas durante o preparo. Guarde na geladeira. Mexa lentamente por 10 minutos antes de usar.
DPBS com Ca2+ & Mg2+	Hyclone	SH30264.FS	DPBS - parte do buffer de isolamento
Ficoll PM400	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	F4375	A medição exata é importante aqui. Pese em garrafa com barra de agitação. Agite vigorosamente após adicionar DPBS. Mantenha na geladeira O/N. Ficará claro pela manhã. Mexa delicadamente por 10-15 min antes de usar. Mantenha no gelo até o uso.
Glicose (D-(+) Dextrose)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	G7528	Concentração de glicose (D-(+) Dextrose): 5 mM
Solução padrão de hidróxido de sódio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	Rolamento 71474	Para ajustar o pH do DPBS
Piruvato de sódio	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA	Pág. 2256	Concentração: 1 mM