Zimografia de peptídeos fluorescentes: uma técnica modificada para detectar a atividade da protease usando substratos fluorogênicos em géis de zimograma

Resumo

Fonte: Deshmukh, A. A. et al. Detecção de atividade de protease por zimografia de peptídeo fluorescente. J. Vis. Exp. (2019)

Neste vídeo, realizamos zimografia, uma técnica eletroforética, para analisar a atividade proteolítica em amostras biológicas.

Protocolo

1. Eletroforese de Amostras Biológicas em Géis Eletrográficos de Peptídeos

1. Dissolva as amostras em tampão de amostra de zimografia convencional (62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 25% de glicerol, 4% de SDS, 0,01% de azul de bromofenol). Para amostras de células e tecidos, recomenda-se ~ 30 μg de proteína total por poço e 50-100 ng de proteína para os padrões MMP.
2. Adicione 400 mL de 1x Tris-Glycine SDS Running Buffer ao aparelho de gel. Carregue até 35 μL de amostra por poço. Execute as amostras a 120 V a 4 °C por 1,5 horas ou até que os padrões de peso molecular indiquem que as proteases de interesse estão dentro da camada de gel de resolução de peptídeos (que tem uma cor laranja visível).
   nota: A maioria das MMPs e suas variantes estão na faixa de 35 a 100 kDa. Quando os padrões de peso molecular indicam que esses pesos estão dentro da camada de gel de resolução de peptídeos, a eletroforese pode ser interrompida. O mesmo princípio pode ser aplicado a outras classes de proteases com pesos moleculares conhecidos. Se houver interesse em detectar múltiplas proteases em uma faixa maior de pesos moleculares, reduza o tamanho da camada de gel de resolução e aumente o tamanho da camada de gel de resolução de peptídeos.
3. Após a eletroforese, remova os géis do de plástico e lave os géis três vezes por 10 min cada em temperatura ambiente sob agitação suave em tampão de renaturação contendo 2,5% de Triton X-100, 1 μM de ZnCl₂ e 5 mM de CaCl₂ em 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5.
4. Transfira os géis para uma solução tampão de revelação contendo 1% de Triton X-100, 1 μM de ZnCl₂ e 5 mM de CaCl₂ em 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5 por 15 min. Substitua por uma solução tampão de revelação fresca e incube os géis a 37 ° C sob agitação suave por 24 horas, certificando-se de que os géis estejam totalmente submersos na solução.
5. Após 24 horas, a imagem é gélmica usando um scanner/gerador de imagens de gel fluorescente usando os filtros de excitação e emissão apropriados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
de gel vazios de 1,5 mm	ThermoFisher Scientific	NC2015
Solução SDS 20%	Ambion	AM9820
3x tampão de amostra de zimografia	Bio-Rad	1610764
Kit Azido-PEG3-Maleimide	Clique em Ferramentas de Química	AZ107
Fonte de alimentação básica PowerPac	Bio-Rad	1645050
Precision Plus Protein Dual Color Standard	Bio-Rad	Rolamento 161-0374
Agulhas hipodérmicas PrecisionGlide	Fisher Científico	14-826