Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
1. Sistema de ultrassom focalizado
NOTA: A configuração descrita é um sistema de interrupção BBB construído internamente com base em componentes disponíveis comercialmente e inclui um cone personalizado impresso em 3D e uma plataforma estereotáxica destacável. O sistema é projetado modular, o que facilita as modificações de acordo com o equipamento disponível e o uso específico. O protocolo descreve o procedimento para a sonoporação de uma área maior na região pontina do cérebro do camundongo. Ao ajustar o local de destino, diferentes partes do cérebro podem ser direcionadas. Neste estudo, foi utilizado um transdutor monoelemento de 1 MHz com distância focal de 75 mm, abertura de 60 mm e área focal de 1,5 x 1,5 x 5 mm (FWHM de pico de pressão). O plano focal do transdutor é posicionado através do crânio do animal no plano horizontal que se cruza com as barras auriculares.
- Selecione um transdutor apropriado para abertura BBB em roedores.
nota: Com base nas propriedades das microbolhas e na frequência empregada, as configurações acústicas, em particular o índice mecânico (IM), estão sujeitas a alterações.
- Coloque o transdutor no cone impresso em 3D.
- Empregue uma membrana mylar acusticamente transparente na extremidade inferior do cone para obter o acoplamento acústico do caminho de propagação do feixe e encha o cone com água desgaseificada.
- Monte o transdutor acima do animal em um estágio linear motorizado, conforme mostrado na Figura 1, permitindo o posicionamento vertical automático do transdutor.
- Projete uma plataforma estereotáxica destacável com base nos requisitos do estudo, que inclui aquecimento regulado por temperatura, barras de mordida e orelha, anestesia e marcadores fiduciais multimodais, conforme mostrado na Figura 1 e na Figura 2. A montagem da plataforma estereotáxica consiste em um sistema de palco linear 2D, que permite o posicionamento automático preciso (< 0,1 mm) do animal sob a viga.
- Conecte o transdutor à cadeia de emissão acústica mostrada na Figura 1, consistindo em um transdutor, um gerador de função e um amplificador de potência.
- Desenvolva um pipeline de processamento de imagem para detectar os marcadores fiduciais multimodais que permitem o direcionamento preciso da sonoporação da área de interesse do cérebro e a coleta dos dados de cavitação detectados pelo hidrofone da agulha.
- Calibrar o sistema e determinar o ponto de focagem do transdutor em correspondência com o posicionamento vertical do animal na plataforma estereotáxica.
2. Preparação Animal
NOTA: O protocolo a seguir é especificado para camundongos, mas pode ser adaptado para ratos. Para esses experimentos, foram usados camundongos Foxn1-/- fêmeas atímicas nuas (6–8 semanas de idade).
- Deixe o animal se aclimatar por pelo menos uma semana no biotério e pese-o regularmente.
- Administre buprenorfina (0,05 mg / kg) por injeção subcutânea (s.c.) 30 minutos antes do tratamento com FUS para iniciar o tratamento analgésico.
- Anestesiar o animal com isoflurano a 3%, 2 L/min O2 e verificar se o animal está profundamente anestesiado. Mantenha os animais anestesiados durante todo o procedimento e monitore a frequência respiratória e a frequência cardíaca para ajustar a concentração de isoflurano conforme necessário.
- Aplique pomada para os olhos para evitar olhos secos e evitar possíveis lesões.
- Remova os pelos do topo da cabeça com uma lâmina e creme depilatório e lave depois com água para remover quaisquer resíduos e evitar irritação na pele.
- Para experimentos com modelos de tumor BLI, injete 150 μL de D-luciferina (30 mg / mL) intraperitoneal (i.p.) com uma seringa de insulina 29G para orientação por imagem BLI.
- Insira um cateter de veia caudal 26–30G e lave o cateter e a veia com um pequeno volume de solução de heparina (5 UI/mL). Encha o cateter com solução de heparina para evitar a coagulação do sangue.
nota: Um bom cateterismo é observado quando há um refluxo de sangue para o cateter. Evite bolhas de ar no cateter para evitar êmbolos. Para evitar pressão de injeção excessiva, certifique-se de que o comprimento do cateter seja o mais curto possível.
- Colocar o animal na plataforma estereotáxica regulada por temperatura para evitar hipotermia.
nota: A hipotermia reduz a circulação sanguínea, o que pode afetar a injeção/circulação de microbolhas e a farmacocinética dos medicamentos.
- Imobilize e fixe a cabeça do animal na plataforma estereotáxica usando barras auriculares e uma barra de mordida. Fixe o corpo com uma alça e prenda a cauda do animal na plataforma.
3. Ultrassom focalizado guiado por imagem in vivo
NOTA: Para este protocolo, foi utilizado um transdutor monoelemento de 1 MHz com pulso tone-burst com duração de 10 ms, MI de 0,4 e frequência de repetição de pulso de 1,6 Hz com 40 ciclos por 240 s. O protocolo é otimizado para microbolhas estabilizadas por fosfolipídios contendo hexafluoreto de enxofre (SF6) como um gás inócuo, em que o diâmetro médio da bolha é de 2,5 μm e mais de 90% das bolhas são menores que 8 μm.
- Coloque a plataforma estereotáxica com o animal montado na modalidade de imagem (por exemplo, BLI ou raio-X) e tire a(s) imagem(ns) do animal.
- Use os marcadores fiduciais multimodais em combinação com o pipeline de processamento de imagem para marcar a posição do animal de acordo com o ponto de foco do transdutor.
- Determine a área-alvo colocando um contorno do cérebro sobre a imagem de raios-X adquirida ou usando imagens BLI para determinar o centro do tumor (Figura 2). A posição de partes específicas do cérebro é especificada no Atlas do Cérebro de Paxinos usando as marcações do crânio bregma e lambda como pontos de referência. Por exemplo, a ponte está localizada em x=-1,0, y=-0,8 e z=-4,5 de lambda.
- Proteja as narinas e a boca do animal com fita adesiva para evitar que o gel de ultrassom interfira na respiração.
- Aplique gel de ultrassom no topo da cabeça do animal.
- Retraia a pele do pescoço dos animais, lubrifique o hidrofone da agulha com gel de ultrassom e coloque o hidrofone da agulha nas imediações do osso occipital.
- Guie o transdutor para a posição correta usando o pipeline de processamento de imagem e o ponto de foco.
- Aplique as configurações pré-configuradas a todos os dispositivos conectados e direcione a região cerebral de interesse.
nota: Dependendo da questão de pesquisa, as regiões tumorais ou cerebrais podem ser sonoporadas como um único ponto focal ou como forma volumétrica, conforme mostrado na Figura 2.
- Ative as microbolhas conforme descrito pelo fabricante. Injete um bolus de 120 μL (5,4 μg) de microbolhas.
- Lave o cateter da veia caudal com solução salina para verificar a abertura do cateter.
- Injete as microbolhas e inicie a insonação.
- Registre a cavitação de microbolhas com o hidrofone de agulha.
- Administre um agente de contraste intravascular ou medicamento após a sonoporação. A dose, o tempo e o planejamento dependem do objetivo do estudo e do medicamento.
nota: O azul de Evans é um agente de cor comum para avaliar a abertura da BHE.
- Monitore o animal até o ponto de tempo predeterminado ou antes do ponto final humano.
