Entrega de genes baseada em eletroporação in utero: uma técnica para injetar DNA de plasmídeo em células cerebelares embrionárias de embriões murinos

Resumo

Fonte: Feng W. et al. Análise de perda de função mediada por CRISPR em células granulares cerebelares usando transferência de genes baseada em eletroporação in utero. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a entrega de DNA de plasmídeo em células neuronais cerebelares de embriões murinos usando eletroporação in utero. Este método é útil para obter compreensão da função in vivo dos genes no desenvolvimento normal do cérebro e as mudanças na expressão gênica das células dos neurônios durante a progressão do tumor.

Protocolo

1. Realizar eletroporação no útero

1. Crie camundongos de 6 a 8 semanas de idade e prepare as ferramentas para eletroporação in utero. Cruze camundongos Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP homozigotos machos com camundongos CD-1 fêmeas. Cronometre a gravidez dos camundongos CD-1 a partir do dia em que o tampão vaginal é detectado (E0.5). Os embriões são eletroporados no dia E13.5.
   1. Puxe os capilares de vidro borossilicato (diâmetro interno: 0.6–0.8 mm) com um extrator de micropipeta. Use as seguintes configurações: P = 500, Calor = 560, Tração = 150, Vel = 75, Tempo = 250. Rotule a ponta capilar com tinta preta para melhor visualização durante a injeção. Apare o cone capilar sob um estereomicroscópio usando uma régua e uma pinça de agulha afiada e apare a ponta em um comprimento de cerca de 6 mm.
   2. Manter a unidade dos capilares para manter o experimento reprodutível. Crie uma aresta chanfrada unilateral durante o corte. A ponta deve ser o mais afiada possível para facilitar a penetração da parede uterina e evitar danos aos tecidos do embrião.
      nota: Como alternativa, use um micro-moedor para ajustar um ângulo de 35°. Os capilares podem ser armazenados em temperatura ambiente em uma placa de Petri de 10 cm em condições livres de patógenos.
   3. Autoclave os instrumentos cirúrgicos.
   4. Misture os plasmídeos sgRNA em partes iguais com pT2K-IRES-Luc até uma concentração final de pelo menos 1 μg/μL para cada plasmídeo e pinte a solução de plasmídeo com verde rápido (concentração final de 0,05%). Prepare a solução de estoque verde rápido a 1% com água destilada livre de endotoxinas e filtre através de um filtro de 0,22 μm para remover as partículas de corante da solução.
      nota: A cotransfecção de pT2K IRES-Luc é opcional, mas permite a identificação de animais eletroporados viáveis após o nascimento usando imagens de bioluminescência. Preparar uma quantidade suficiente de mistura de plasmídeos para o número total de ratinhos prenhes a operar. Use cerca de 15–20 μL de mistura por camundongo (~ 12 embriões). Prossiga imediatamente com a cirurgia.
2. Prepare os ratos para a cirurgia
   1. Anestesiar camundongos CD-1 prenhes com isoflurano. Induzir a anestesia em uma caixa com 3–4% de isoflurano (fluxo de oxigênio: 1,5 L/min) e mantê-la com 2% de volume durante a cirurgia via cone nasal.
      nota: A cirurgia completa não deve demorar mais de 30 minutos. Reduza o número de embriões injetados e eletroporados, se necessário. Use luvas estéreis para cirurgia.
   2. Coloque o mouse de costas em uma almofada de aquecimento e ajuste a anestesia.
   3. Injetar analgésico (Metamizol, 800 mg / kg de peso corporal, por via subcutânea (s.c.), depósito de 24 h).
      nota: Você pode usar outros analgésicos autorizados além do Metamizol.
   4. Aplique pomada para os olhos para evitar o ressecamento dos olhos durante a cirurgia.
   5. Fixe os membros com fita adesiva e esterilize o abdômen com um desinfetante. Cubra o mouse com gaze, deixando apenas a área cirúrgica exposta. Espalhe etanol 70% sobre a área cirúrgica e gaze.
   6. Faça uma incisão na pele de cerca de 2 cm de comprimento e alargue a lacuna suavemente com uma tesoura cirúrgica reta. Localize a linha alba e faça uma segunda incisão um pouco menor através do peritônio usando uma tesoura de tecido com ponta romba.
   7. Umedeça a cavidade abdominal aberta com 1x PBS estéril pré-aquecido.
   8. Extraia cuidadosamente os cornos uterinos da cavidade abdominal usando uma pinça anelar. Puxe suavemente agarrando a parede uterina apenas no espaço entre os sacos vitelinos. Evite qualquer pressão sobre o embrião enquanto o puxa pela incisão. Amplie a incisão, se necessário, e tome cuidado extra para posicionar os cornos uterinos no abdômen, sem comprimir o fluxo sanguíneo pela artéria uterina.
      nota: Em alguns casos, é aconselhável extrair um corno uterino de cada vez e substituí-lo antes de prosseguir com o segundo corno uterino.
3. Injeção e eletroporação de DNAs plasmidiais
   1. Aspirar cerca de 15 μL de solução plasmídica colorida com o capilar de vidro preparado. Evite bolhas de ar durante este processo.
      nota: A solução de plasmídeo pode entupir a ponta facilmente se sua concentração for alta. Teste o capilar liberando um pouco de DNA logo antes da injeção.
   2. Segure suavemente o embrião com uma pinça de anel e localize a área do pescoço.
      nota: Se o embrião estiver em uma posição difícil de injetar, pule-o e vá para o próximo embrião. O aumento do reposicionamento do embrião pode aumentar as chances de danos a eles.
   3. Perfure lentamente com a ponta do capilar de vidro previamente preparado no quarto ventrículo, penetrando através do rombencéfalo dorsal e, em seguida, injete cerca de 1 μL da mistura de plasmídeos. Confirme se o DNA tingido não vazou do cérebro e é visível como uma estrutura em forma de diamante.
      nota: Como opção, use lupas de 2,5 vezes para melhor visualização do quarto ventrículo e dos vasos sanguíneos circundantes. Fornecer impulsos eléctricos imediatamente após a injecção para evitar a difusão da solução plasmídica para os outros ventrículos.
   4. Aplique pulsos quadrados elétricos (5 pulsos, 32 mV, 50 ms-on, 950 ms-off) com pinças de platina semelhantes a fórceps (consulte a Tabela de Materiais). Coloque os eletrodos lateralmente com o pólo negativo cobrindo a orelha e o pólo positivo posicionado no primórdio cerebelar sobre a parede uterina. Use placas de eletrodos de 5 mm de diâmetro para eletroporação eficaz de embriões E13.5.
      nota: Aumentar a taxa de sobrevivência dos filhotes manipulando^{menos de 2}/3 do número total de embriões por mãe. Evite embriões muito próximos ao colo do útero. Se manipulados, podem causar complicações durante o trabalho de parto e comprometer toda a ninhada. Se os eletrodos estiverem muito próximos do coração do embrião, isso pode causar parada cardíaca.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Banda de autoclave	Kisker Biotech	150262
Porator Eletro Quadrado	BTX	ECM830
Kit Maxi Endofree	Qiagen	Rolamento 12362
etanol	Merck	107017
Pomada para os olhos (Bepanthen)	Bayer	81552983
Verde Rápido	Merck	104022
Filtro (0,22 μm)	Merck	F8148
Fórceps reto	Ferramentas de Belas Ciências	91150-20
Gaze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm)	Fisher Científico	15387311
Capilar de vidro com filamento	Narishige	GD1-2
Almofada de aquecimento	ThermoLux	463265 / -67
Isoflurano	Zoetis	TU061219
Fórceps de anel	Ferramentas de Belas Ciências	11103-09
Estereomicroscópio	Nikon	C-PS
Tesoura cirúrgica	Ferramentas de Belas Ciências	Rolamento 91460-11
Tesoura cirúrgica com ponta romba	Ferramentas de Belas Ciências	14072-10
Pinças c/ 5mm- eletrodos de disco Platinum	Xceltis GmbH	CUY650P5
Metamizol	WDT
Fio de sutura de seda não estéril (0,12 mm)	Ferramentas de Belas Ciências	18020-50
PBS (1x)	Tecnologias da Vida	14190169
Tesoura de tecido sem corte (11,5 cm)	Ferramentas de Belas Ciências	14072-10
pCAG-EGxxFP	Addgene	Rolamento 50716
plasmídeo pX330	Addgene	Rolamento 42230