Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação dos camundongos e cirurgia
NOTA: Camundongos C57BL / 6J machos e fêmeas de 8 semanas de idade são usados neste estudo. As condições cirúrgicas seguem as normas da IACUC de nossa instituição. Os instrumentos são esterilizados, a superfície de trabalho cirúrgica é desinfetada, o animal é desinfetado e o cirurgião usa luvas estéreis.
- No dia anterior à cirurgia, anestesiar o camundongo com isoflurano a 2% e, em seguida, remover o pelo ao longo do comprimento do fêmur no lado dorsal com uma lâmina fina ou um agente químico de depilação.
- No dia da cirurgia, anestesiar os camundongos com isofluorano a 2% em uma câmara de indução. Confirme a anestesia por um estímulo de pinça do dedo do pé e falta de resposta.
- Aplique pomada veterinária nos olhos para evitar o ressecamento sob anestesia.
- Coloque o camundongo anestesiado em seu lado ventral e prenda suavemente cada membro com fita hipoalergênica para criar uma leve tensão no membro a ser injetado. A anestesia é mantida com isoflurano administrado por meio de um vaporizador de precisão e cone nasal.
- Limpe o local da injeção com Betadine e novamente com álcool 70%. Repita esse processo mais duas vezes. Certifique-se de que nenhum cabelo solto permaneça no campo cirúrgico.
- Faça uma incisão de 1 cm com uma tesoura pequena cerca de 2 mm abaixo e paralela ao fêmur. Retraia a pele com uma pinça lateralmente para expor os músculos por baixo.
- O nervo ciático corre profundamente para os músculos glúteo máximo e bíceps femoral. Separe esses dois músculos ao longo de um plano fascial com uma pequena tesoura e exponha o nervo ciático por baixo. Liberte o nervo dos músculos circundantes usando dissecção romba.
- Retire 3 μL de células cancerígenas (cerca de 50.000 células) do pellet para uma seringa de 10 μL.
nota: Alternativamente, extraia 3 μL de PBS como controle.
- Coloque uma pequena espátula de metal embaixo do nervo no ponto de injeção para suporte. Sob visualização com um microscópio de dissecação, insira a agulha no nervo contra a base de metal, mantendo a agulha o mais paralela possível ao nervo após a inserção. Tenha cuidado para não perfurar a parte de trás do nervo. Minimize o manuseio do nervo o máximo possível durante todo esse processo.
- Injete lentamente no nervo por mais de 5 s. A formação de um bulbo na área de injeção indica uma boa injeção. Em seguida, deixe a agulha no lugar por 3 s antes de removê-la suavemente. Manter a agulha no lugar por 3 s minimiza o refluxo das células para fora do nervo.
nota: A injeção pode ser realizada em direção ao nervo distal ou à medula espinhal. É importante permanecer consistente dentro de um conjunto de experimentos. Se as células derramarem para fora, o animal não deve ser incluído na análise do experimento. Com a experiência, esses eventos são muito raros.
- Retorne o nervo à sua posição original. Cubra o nervo com os músculos sobrepostos. Trate os camundongos com analgesia adequada e, em seguida, feche a pele com suturas de nylon 5-0.
- Coloque o camundongo sozinho em uma gaiola limpa para observação durante a recuperação, até que ele desperte completamente da anestesia.
nota: Leva de 5 a 15 minutos para o animal recuperar a consciência plena. O animal não é deixado sozinho até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter a decúbito esternal. O animal não é devolvido à companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. Depois disso, avalie a recuperação pelo menos uma vez a cada 24 h por 72 h.
