Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Extração do Nervo Ciático
- Pegue camundongos cujos nervos ciáticos são previamente injetados com células cancerígenas e eutanasia-los com CO2. Coloque o mouse em seu lado ventral e estabilize os membros distais usando alfinetes.
- Remova a pele do lado dorsal do membro injetado e do tronco.
- Usando dissecção romba, exponha o nervo ciático profundamente nos músculos.
- O nervo corre entre o ílio e o sacro. Para ter acesso ao nervo na região da medula espinhal, separe os dois ossos. Primeiro, insira uma tesoura fechada na área estreita onde o nervo ciático está localizado e, em seguida, abra a tesoura enquanto segura o mouse. Seja delicado e mantenha a integridade do nervo ciático durante a dissecção.
- Dissecar cuidadosamente o nervo ciático distalmente ao final do fêmur e proximalmente à medula espinhal.
nota: Os nervos invadidos são extremamente frágeis e propensos a quebrar sob tensão ou manuseio forçado.
- Colha o nervo cortando primeiro sua extremidade distal. Levante cuidadosamente o nervo enquanto o libera do tecido adjacente. Corte o nervo na extremidade proximal, o mais próximo possível de sua saída da coluna vertebral.
- Registre então a duração bruta da invasão usando um paquímetro Vernier. Esta estimativa macroscópica é apenas indicativa.
2. Processamento e quantificação de nervos
- Incorpore o nervo dissecado no composto OCT. Certifique-se de colocar os nervos longitudinalmente e o mais plano possível na parte inferior do molde.
- Indique no o lado proximal e distal do nervo, marcando a letra P (Proximal) e D (Distal).
- Coloque os nervos embutidos em cima do gelo seco, se eles não forem seccionados imediatamente. A amostra pode ser preservada a -80 °C por várias semanas.
- Corte amostras usando um micrótomo Cryostat com 5 μm de espessura e coloque seções em lâminas de vidro. Se possível, encaixe duas seções de nervo por lâmina. Indique o lado proximal do nervo.
- Lâminas de coloração usando coloração H&E.
- Digitalize digitalmente seções de nervos coradas com um scanner de lâminas que fornece dados digitais de alta resolução.
- Usando um software de imagem, quantifique o comprimento da invasão clicando no botão de medir distância, área de invasão ou outros parâmetros desejados. Para uma boa estimativa da duração da invasão, use várias seções (2 a 4) do mesmo nervo.
