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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Prepare camundongos para injeção de células tumorais
- Anestesiar um camundongo por injeção intraperitoneal (i.p.) de coquetel de cetamina / xilazina (cetamina 100 mg / kg, xilazina 10 mg / kg).
- Confirme a anestesia completa beliscando os pés do animal e observe a falta de resposta.
- Coloque o mouse em uma placa de vidro (usada para fundir géis de proteína) e prenda com elásticos.
- Se necessário, remova os pelos do pescoço raspando ou aplicando uma pequena quantidade de produto depilatório e limpando os pelos com papel toalha.
nota: Se estiver usando ratos nus, pule esta etapa, pois eles não têm pelos no corpo.
- Limpe a pele do pescoço aplicando iodopovidona e álcool 70%.
- Coloque o mouse no palco do microscópio de dissecação
- Faça uma incisão na pele com ~ 1 cm de comprimento com um bisturi cirúrgico.
- Disseque o músculo sem corte com uma pinça dentada para expor a artéria carótida por baixo.
- Separe a artéria carótida do nervo vago adjacente com uma pinça cirúrgica.
- Usando uma pinça cirúrgica, separe um pouco de algodão de uma bola de algodão, umedeça e molde em uma bola de algodão menor. Coloque esta bola de algodão hidratada com tampão embaixo da artéria carótida do local pretendido da injeção.
- Coloque uma sutura distal e proximal à bola de algodão e faça nós soltos. Aperte o nó proximal para bloquear o fluxo sanguíneo para o local da injeção.
- Prossiga para a injeção de células cancerígenas se a artéria carótida na bola de algodão parecer totalmente pressurizada com sangue vermelho fresco.
2. Injeção de células cancerígenas na artéria carótida
- Vórtice e atraia 100 μL de células cancerígenas para a seringa.
- Sob o microscópio de dissecação, insira lentamente a agulha 31G (com o chanfro para cima) no lúmen da artéria carótida em cima da bola de algodão.
- Injete lentamente as células da seringa na artéria carótida. A injeção bem-sucedida pode ser observada ao microscópio pela mudança de cor dos vasos sanguíneos e musculatura próximos quando as células cancerígenas tamponadas são empurradas para a circulação.
- Quando a injeção de todo o volume estiver completa, levante a artéria carótida distal suavemente para evitar regurgitação.
- Aperte rapidamente o nó distal para concluir o processo de injeção.
- Depois de completar a injeção, aperte as ligaduras e apare o excesso de sutura de seda com uma microtesoura sob o microscópio de dissecação. Mova para trás o músculo separado para cobrir o local da ferida. Feche a pele com dois grampos.
3. Recuperação Cirúrgica
- Mova o animal operado para uma almofada de aquecimento para recuperação. Pode levar de 30 a 60 minutos para os animais recuperarem a consciência. Enquanto isso, administre buprenorfina (0,05 mg / kg) por injeção subcutânea como analgesia pós-cirúrgica.
nota: A analgesia deve ser fornecida de acordo com o protocolo local aprovado pela IACUC.
- Assim que os animais despertarem e retomarem seu comportamento normal, devolva os ratos ao local de alojamento. Forneça aos camundongos comida em gel por vários dias após a cirurgia. Mantenha um registro cirúrgico e mantenha-o na sala.
4. Imagem In Vivo Não Invasiva
- Para células marcadas com construções repórter de luciferase, meça a eficiência da injeção de células cancerígenas usando o sistema de imagem in vivo.
nota: A imagem não é realizada no dia da injeção para evitar estresse excessivo aos animais de pesquisa.