Transplante ortotópico de longo prazo de células tumorais em embriões de peixe-zebra: um método eficiente para entregar células tumorais no quarto ventrículo de embriões de peixe-zebra para análise de longo prazo do comportamento das células tumorais

Resumo

Fonte: Casey, M. J. et al. Transplante de tumores cerebrais pediátricos de peixe-zebra em hospedeiros imunocompetentes para estudo de longo prazo do comportamento das células tumorais e resposta a medicamentos.J. Vis. Exp. (2017)

Este vídeo demonstra o transplante ortotópico de células tumorais cerebrais de peixe-zebra para o quarto ventrículo de um embrião de peixe-zebra imunocompetente. Este procedimento permite o estudo a longo prazo da invasão e do comportamento das células tumorais.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Injetando a suspensão tumoral no quarto ventrículo de um embrião de 2-dpf

1. Transfira de 10 a 20 embriões descorionados anestesiados para a periferia da placa de injeção usando uma pipeta de transferência; os embriões devem cair lateralmente na placa de injeção, com os ventrículos claramente visíveis e acessíveis. Use uma sonda angular para ajustar os embriões conforme necessário e posicione-os longe da borda externa da placa de injeção.
2. Carregue 1–2 μL da suspensão de células tumorais na agulha de injeção usando pontas de pipeta de carregamento de gel e insira a agulha no manipulador.
3. Abaixe manualmente o manipulador, segurando a agulha em um ângulo de 45°. Ajuste os botões do micromanipulador nas direções x, y e z até que a agulha esteja logo acima e aproximadamente 5 mm à direita da cabeça do embrião. Olhe através das oculares do estereomicroscópio e ajuste lentamente o micromanipulador na direção x até que a agulha perfure o quarto ventrículo do embrião. Não permita que a agulha perfure o coração ou a gema.
   1. Empurre o pedal acoplado ao microinjetor para injetar a suspensão de células tumorais.
      nota: A pressão e o tempo de injeção variam de acordo com o tamanho do furo da agulha, mas um bom ponto de partida é de 5 a 10 PSI e 50 a 100 ms. O volume de células tumorais injetadas pode ser avaliado com técnicas padrão de gota de óleo por meio de injeção em óleo mineral, se desejado. Injeções de 500 pL com um diâmetro de gota de 0,1 mm normalmente dão os melhores resultados.
4. Enxágue suavemente os embriões injetados da placa de injeção e coloque-os em uma placa de Petri usando água fresca de ovo (0,6 g/L de sal de aquário em água de osmose reversa + 0,01 mg/L de azul de metileno). Mantenha os embriões em água com ovo para os procedimentos restantes ou até que sejam cultivados em tanques.
5. Inspecionar os embriões injetados sob um estereomicroscópio de fluorescência. Confirme se a pressão de injeção, o ângulo, o tamanho da agulha e a viscosidade da suspensão celular resultam em células tumorais preenchendo 25-50% do espaço do ventrículo. Ajuste esses parâmetros conforme necessário.
6. Repita as etapas 1.1 a 1.5 para todos os embriões restantes. Anestesiar os embriões adicionais conforme necessário.
   nota: Um usuário experiente pode injetar até 300 embriões em 3 a 4 horas.
7. Coloque os embriões de volta na incubadora a 28 ° C durante a noite.
8. No dia seguinte, avalie a sobrevivência do embrião examinando características morfológicas e fisiológicas, como o desenvolvimento normal do coração e do cérebro, conforme descrito.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Água de ovo	Em casa		Manutenção de embriões, fabricação de placa de injeção
Placa de Petri	Thermo Fisher	FB0875711Z	Alojamento de embriões, fabricação de placa de injeção
Recipiente de vidro	Qualquer marca comercial		Fazendo a placa de injeção
Micropipetas	Qualquer marca comercial		Ressuspensão e transplante tumoral
Sonda angular	Ferramentas de Belas Ciências	10140-02	Manipulação de embriões
Pipeta de transferência	Qualquer marca comercial		Manipulação de embriões
Estereomicroscópio	Olimpo	SZ61	Transplante tumoral
Estereomicroscópio fluorescente	Olimpo	SZX16	Transplantes tumorais por imagem
Câmera de microscópio	Olimpo	DP-72	Transplantes tumorais por imagem
incubadora	Qualquer marca comercial		Manutenção de embriões, aquecimento da placa de injeção
N2	Qualquer marca comercial		Para configuração de microinjetores
Capilar de vidro (sem filamento)	Instrumentos de precisão mundiais	TW120-4	Transplante tumoral
Extrator de agulhas	Instrumentos Sutter	Pág. 97	Transplante tumoral
Pontas de microcarregadeira	Eppendorf	930001007	Transplante tumoral
Microinjetor	Aparelho de Harvard	PLI-90	Transplante tumoral
Tricaína-S (MS-222)	Química Ocidental	TRS1	Transplante anestésico de tumores
agarose	Denville	CA3510-8	Fazendo a placa de injeção
microondas	Qualquer marca comercial		Fazendo a placa de injeção
escala	Qualquer marca comercial		Fazendo a placa de injeção
Luvas	Qualquer marca comercial		Todos os aspectos do protocolo
Pronase	Roche Diagnósticos	11459643001	Embriões descorionados
Lâmina	Thermo Fisher	12640	Preparação da agulha
Copo de 50 mL (2 polegadas de diâmetro)	Qualquer marca comercial		Fazendo a placa de injeção
Recipiente de vidro	Qualquer marca comercial		Fazendo a placa de injeção
Azul de metileno	Sigma-Aldrich	M9140	Adicione à água do ovo para evitar o crescimento de fungos