Entrega intranasal de células-tronco neurais terapêuticas (NSCs) em modelo murino: um procedimento para entrega direcionada a tumor de NSCs carregadas com vírus oncolítico em modelo de camundongo portador de tumor cerebral

Neste artigo

Resumo

Fonte: Yu, D. et al. Entrega intranasal de células-tronco terapêuticas ao glioblastoma em um modelo de camundongo. J. Vis. Exp.(2017)

Este vídeo demonstra a entrega intranasal de células-tronco neurais terapêuticas carregadas de vírus oncolíticos em um modelo de camundongo portador de tumor cerebral. A administração intranasal não invasiva de células-tronco contorna a barreira hematoencefálica, facilitando sua entrega ao local do tumor no cérebro para aplicações terapêuticas.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Pré-condicionamento hipóxico de NSCs humanos (Figura 1A)

NSCs cultivados em placas em frascos de cultura T75 até que 90% de confluência seja atingida.
Colocar os frascos de cultura de células dentro de uma câmara/incubadora de CO₂ humidificada com níveis de 1% de O₂ mantidos durante 24 h, através de um fornecimento de gás N₂ controlado por um medidor de caudal incorporado automatizado. Essas células são chamadas de ^HNSCs. Os ^{NSCs de controle N}são gerados como:
1. Manter NSCs humanos (clone HB1.F3.CD) em meio DMEM com 10% de FBS e 1% de penicilina-estreptomicina em uma incubadora umidificada a 37 ° C sob 95% de ar ambiente e 5% de CO₂.

2. Carregamento de NSCs Humanos com Vírus Oncolítico (Figura 1B-1H)

Infecte ^NNSCs, ^HNSCs com 50 partículas virais de adenovírus replicativo condicional (CRAd)-S-pk7/célula.
Após 2 h de incubação em temperatura ambiente com batidas periódicas, lave as células três vezes com meio para remover as partículas virais não ligadas e suspenda as células em solução salina estéril para injeção.
cuidado: Realizar todos os procedimentos de cultura de células in vitro relacionados com o vírus em instalações com a designação de nível de biossegurança adequada, como BSL2. Equipamentos de proteção individual apropriados devem ser usados pelos pesquisadores que lidam com o vírus oncolítico de acordo com as diretrizes institucionais das instalações para animais.

3. Entrega intranasal de NSCs terapêuticos (Figuras 1D e Figura 2D)

Cultive e colete NSCs (^NNSCs, ^HNSCs).
Anestesiar camundongos via injeção intravenosa de uma mistura de cetamina e xilazina de acordo com o procedimento:
1. Anestesiar o animal com base no peso corporal usando os reagentes aprovados, ou seja, por meio de uma injeção intraperitoneal (i.p.) de uma mistura de cetamina (50–100 mg/kg; consultar IACUC institucional para faixa de dose aprovada) e xilazina (5–10 mg/kg; consultar IACUC institucional para faixa de dose aprovada) em solução salina estéril de 200–250 μL, ou via anestesia com isoflurano a 4–5% usando um dispositivo inalatório.
Coloque os ratos em uma cortina limpa voltada para cima com uma almofada de aquecimento embaixo para manter a temperatura corporal. Ajuste um travesseiro acolchoado feito de toalhas de papel enroladas com fitas adesivas para garantir o ângulo vertical das narinas quando colocado sob a cabeça do mouse.
Usando uma micropipeta, dispense 2 μL de suspensão NSC em cada narina do camundongo. Confirme visualmente a aspiração da gota antes de passar para o próximo mouse. O número total de células entregues pode ser determinado pelo usuário; use 62.500–125.000 células/μL, de modo que 0,5–1 milhão de células possam ser administradas em doses de 4 x 2 μL.
Use um temporizador para garantir intervalos de 5 minutos entre cada administração de suspensão celular, até 4 vezes.
Permita que os animais recuperem a mobilidade em uma câmara de recuperação, com a posição supina mantida durante todo o tempo.

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Resultados

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Figura 1: Um fluxograma para procedimentos gerais de preparação de células-tronco envolvidos antes da administração intranasal. (A-C) Pré-tratamento hipóxico ou modificações genéticas de células-tronco para superexpressar CXCR4. (B-D) As etapas de lavagem, dissociação enzimática, coleta de células e contagem são realizadas para carregamento subsequente de células-tro...