Geração de Microtumores: Uma Técnica de Cultura In Vitro para Cultura de Microtumores 3D para Analisar a Resposta ao Tratamento Medicamentoso

Resumo

Fonte: Gilbert, A. N. et al. Geração de microtumores usando sistema de cultura de biogel humano 3D e células de glioblastoma derivadas de pacientes para perfil cinômico e teste de resposta a medicamentos. J. Vis. Exp. (2016)

Neste vídeo, geramos microtumores a partir de células tumorais derivadas de pacientes usando biogel humano 3D. Esses microtumores se assemelham muito ao microambiente tumoral in vivo e servem como plataformas potenciais para testes de drogas.

Protocolo

1. Geração de Microtumor

1. Preparação de reagentes
   1. Prepare o NBM completo adicionando o seguinte a um frasco de 500 mL de Neurobasal Media (NBM) para preparar o NBM completo: 10 mL de suplemento B-27 sem vitamina A, 5 mL de suplemento de N2, 100 μL de EGF, 100 μL de fator de crescimento de fibroblastos (FGF)-Basic, 5 mL de anfotericina B, 0,5 mL de gentamicina, 5 mL de L-glutamina e prepare biogel humano de alta densidade neutralizado (HuBiogel) (HDHG a 3 mg / mL) por protocolo interno. Matrizes de biogel semelhantes também podem ser usadas.
2. Produção e cultura de microtumores
   1. Obtenha células PDX recém-dissociadas como suspensão de célula única em NBM completo, no gelo.
   2. Misture a suspensão celular com um volume igual de solução de azul de tripano (0,4% em PBS) e analise usando hemocitômetro para determinar o número e a viabilidade celular por exclusão de azul de tripano. Remova o volume necessário para gerar 50.000 células/microtumor onde volume = (50.000 células/tumor * # tumores)/(contagem de células viáveis / 1 mL) e coloque em um tubo cônico fresco.
   3. Concentrar as células por centrifugação a 150 x g, durante 8 min, à temperatura ambiente. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular com uma solução gelada de HDHG numa proporção final de 1 parte de células em FBS e 4 partes de HDHG.
   4. Use uma pipeta eletrônica multicanal para dispensar 10 μL por mistura de célula de pino-HDHG em uma placa de aço de 96 pinos (com revestimento hidrofóbico) para gerar microtumores (grânulos de 2 mm, cada um contendo 50.000 células).
   5. Coloque as esferas tumorais 3D dentro da incubadora de cultura de tecidos (37 °C, 5% CO₂, umidificado) por 15 min para gelar as contas.
   6. Após a gelificação, transfira os microtumores (10 μL) para uma câmara de cultura de suspensão personalizada (50 mL) ou placa de cultura de grande volume (10 cm) contendo NBM completo usando a pipeta eletrônica multicanal e o dispositivo de pino personalizado.
   7. Após 1–2 dias na incubadora de cultura de tecidos, transfira os microtumores para placas de cultura de 96 poços contendo 50 μL NBM/poço usando uma pipeta dispensadora de boca larga e execute vários protocolos de ensaio e análise.
3. Tratamento medicamentoso e manutenção de microtumores
   1. Selecione as concentrações finais para o teste de drogas.
      NOTA: Se o medicamento tiver eficácia conhecida em cultura 2D, selecione 2x o IC50 como a concentração de dose intermediária e selecione diluições seriais de 3 vezes acima e abaixo para um total de 5 níveis de dose. Por exemplo, se o IC50 for 9 μM para o medicamento em cultura 2D, selecione 2 μM, 6 μM, 18 μM, 54 μM e 162 μM como concentração final para o teste de medicamento.
   2. Prepare 2x solução de dosagem de medicamento em NBM completo a partir de estoque de dimetilsulfóxido (DMSO). Dilua a solução de dosagem em meio DMSO a 1% para preparar uma diluição serial de 5 doses e 3 vezes.
   3. Adicione 50 μL de solução dosadora ao poço de microtumor contendo 50 μL em placas de ensaio para atingir uma concentração final de DMSO de 0,5%. Repita para cada réplica (por exemplo, 4) em cada dose de medicamento determinada na etapa 1.3.1.
   4. Mantenha as culturas em incubadora de cultura de tecidos umidificada a 37 °C, 5% de CO₂ por 1 a 14 dias. Culturas de alimentação duas vezes por semana, atualizando o meio e a solução do medicamento como acima.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Colagenase-I	Sigma-Aldrich	CO130
Neurobasal-A	Tecnologias da Vida	Rolamento 10888-022
Suplemento N-2	Tecnologias da Vida	17502-048	1x concentração final
Suplemento B-27 sem Vitamina A	Tecnologias da Vida	Rolamento 12587-010	1x concentração final
FGF-básico humano recombinante	Tecnologias da Vida	PHG0266	Concentração final de 10 ng/mL
L-Glutamina	Corning Cellgro Mediatech	25-005-CI	Concentração final de 2 mM
gentamicina	Tecnologias da Vida	15750-060	Concentração final de 50 ng/mL
Azul Trypan	Perfurar ThermoScientific	Rolamento 15250-061
Hubiogel de alta densidade	Vivo Biociências	HDHG-5
Dmso	pescador	BP231	Para dissolução de calceína AM e compostos
Solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco com Ca/Mg	Corning Cellgro Mediatech	20-030-CV	Diluído a 1x com água ultrapura MiliQ (para lavagem pré-fixação)
10% de formalina tamponada neutra	protocolo	Telefone: 032-060
Placas de Petri de vidro de 100 mm	pescador	08-748D