Indução de glioblastoma usando transposição mediada por SB: uma técnica para gerar um novo modelo de camundongo usando integração mediada por transposon do plasmídeo SB no cérebro de camundongo neonatal

Resumo

Fonte: Calinescu, A. A. et al. Integração mediada por transposon do DNA do plasmídeo na zona subventricular de camundongos neonatais para gerar novos modelos de glioblastoma. J. Vis. Exp. (2015)

Este vídeo descreve uma técnica eficiente para induzir glioblastomas (GBM) usando DNA de transposon injetado nos ventrículos de camundongos neonatais. As células da zona subventricular, que captam o plasmídeo, se transformam, proliferam e geram tumores com características histopatológicas do GBM humano.

Protocolo

1. Injeções Neonatais Intra-Ventriculares

1. Três a quatro semanas antes do experimento, monte uma gaiola de reprodução de camundongos com um macho e uma fêmea e um iglu colorido de plástico. Isso proporciona um ambiente enriquecido e auxilia no processo de acasalamento.
2. Quando a gravidez for confirmada, remova o macho para uma nova gaiola. Dezoito dias após o acasalamento, monitore a gaiola diariamente para o parto. Realize injeções intraventriculares no dia 1 pós-natal (P1).
3. Preparação da solução injetável.
   NOTA: A solução de injeção é feita misturando o DNA do plasmídeo com o reagente de transfecção para criar as partículas para transfecção. Abaixo está um exemplo sobre a preparação de uma solução de injeção usando um plasmídeo que codifica a transposase e a luciferase da Bela Adormecida: pT2/SB100x-Luc e dois plasmídeos de transposon: pT/CAGGS-NRASV12 e pT/CMV-SV40-LgT, na proporção de 1:2:2. Todos os plasmídeos têm uma concentração de 2 μg/μL.
   1. Prepare a solução de DNA adicionando: 4 μg (2 μL) de pT2 / SB100x-Luc, 8 μg (4 μL) de pT / CAGGS-NRASV12 e 8 μg (4 μL) de pT / CMV-SV40-LgT e 10 μL de glicose a 10% a um volume final de 20 μL a uma concentração de 1 μg / mL de DNA e 5% de glicose.
   2. Prepare a solução de PEI adicionando 2,8 μL de PEI de jato in vivo, 7,2 μL de água estéril e 10 μL de glicose a 10% até uma concentração final de glicose a 5%.
   3. Adicione a solução de PEI à solução de DNA, misture e vortex e deixe descansar em temperatura ambiente (RT) por 20 min. A solução está agora pronta para injeção. Após uma hora em RT, manter a solução no gelo.
   4. Encaixe uma seringa limpa de 10 μL equipada com uma agulha hipodérmica de 30G com bisel de 12,5° na microbomba (Figura 1 #1).
4. Para verificar o bom funcionamento do sistema de injeção, use o injetor automático (Figura 1 #1) para retirar 10 μL de água para a seringa e, em seguida, esvazie a seringa completamente.
5. Resfrie o estágio estereotáxico neonatal (Figura 1 # 3) com uma pasta de gelo seco e álcool a uma temperatura de 2 a 8 ° C.
6. Induza a anestesia colocando os filhotes em gelo úmido por 2 min. A anestesia continuará na estrutura estereotáxica gelada pelo restante do procedimento. Manter a temperatura da estrutura acima de zero, entre 2–8 °C, evitará queimaduras térmicas. Como precaução especial, os filhotes podem ser embrulhados em gaze antes de serem colocados no gelo úmido.
7. Encha a seringa com a solução de DNA/PEI.
8. Imobilize o filhote na estrutura estereotáxica colocando a cabeça entre as barras auriculares cobertas de gaze (Figura 1b). Certifique-se de que o lado dorsal do crânio esteja horizontal, paralelo à superfície da estrutura e que as suturas cranianas estejam claramente visíveis. Limpe a cabeça com etanol 70%.
9. Abaixe a agulha da seringa e ajuste as coordenadas estereotáxicas usando mostradores da estrutura estereotáxica até que a agulha toque o lambda (a interseção da linha média dos ossos parietal e occipital) (Figura 1b).
10. Levantar a agulha e ajustar as coordenadas estereotáxicas para 0,8 mm lateral e 1,5 mm rostral para a lambda (figura 1b).
11. Abaixe a agulha até que ela toque e faça covinhas leves na pele. Meça as coordenadas. Abaixe a agulha mais 1,5 mm. A agulha perfurará a pele e o crânio e passará pelo córtex para entrar no ventrículo lateral (Figura 1c).
12. Usando o injetor automático, injete 0,75 μL da solução de DNA/PEI a uma taxa de 0,5 μL/min.
13. Mantenha o filhote na estrutura por mais um minuto para permitir que a solução se disperse nos ventrículos. Enquanto isso, anestesiar outro filhote, no gelo por 2 min em preparação para a próxima injeção.
14. Levante a agulha com cuidado e devagar, e coloque o filhote sob uma lâmpada de aquecimento. Monitore a respiração e a atividade. Se necessário, forneça uma estimulação suave dos membros até a primeira respiração.
15. Devolva o filhote à mãe depois de aquecido, tenha atingido uma cor rosada, esteja respirando regularmente e esteja ativo, normalmente 5–7 min. Se mais de um filhote for injetado por vez, mantenha todos os filhotes juntos até que todas as injeções sejam feitas. Se as injeções demorarem mais de 30 minutos, devolva metade dos filhotes após os primeiros 30 minutos e o restante no final do procedimento.
16. Monitore se a mãe é responsiva e carinhosa com seus filhotes. Se necessário, adicione uma mãe de aluguel à gaiola.
17. Certifique-se de que o intervalo entre colocar o filhote no gelo e colocá-lo sob a lâmpada de aquecimento seja inferior a 10 min. Quanto mais rápido o procedimento, melhor a sobrevida. Normalmente, o tempo que leva para anestesiar e injetar um filhote é de 4 min.

Resultados

Figura 1: Configuração experimental e guias para injeções intra-ventriculares em camundongos neonatais. (uma)Uma armação estereotáxica (2) com mostradores micrométricos está equipada com um injector automático que contém uma seringa de 10 μl (4). Dentro da estrutura em U, uma estrutura de adaptador neonatal é presa com segurança (3). O painel de controle do injetor automático (1) per...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Padrão de laboratório da Stoelting com adaptadores de rato e camundongo	Stoelting	Rolamento 51670	Outras empresas produzem quadros semelhantes, qualquer um deles com pequenos adaptadores de mouse é adequado
Injetor estereotáxico por excelência (QSI)	Stoelting	Rolamento 53311	As injeções podem ser feitas sem ele, mas o injetor automático permite maior reprodutibilidade e conveniência
Seringa de MICROLITRO de 10 μL série 700 instalada à mão	Hamilton	Modelo 701	Este modelo de seringa fornecerá de 0,5 a 500 μL de solução de forma confiável. Outras seringas (por exemplo, 5 μL, Modelo 75) também podem ser usadas
Agulha hipodérmica de calibre 30 (1,25", chanfro de 15^{o}	Hamilton	S/O# 197462	Esta agulha é ideal para perfurar a pele e o crânio de um camundongo neonatal sem a necessidade de outros procedimentos invasivos. Se ficar opaco (não entrar facilmente na pele), precisa ser substituído.
Jato in vivo PEI	Transfecção Polyplus	201-10G	Alíquota em pequenos volumes e manter a -20ºC
D-Luciferina, Sal de Potássio	Goldbio.com	SorteK-1g	Outras fontes de lucifierase de vaga-lume são igualmente adequadas
Solução de Hematoxilina Modificada por Harris	Sigma Aldrich	HHS128-4L