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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Dissecação
NOTA: Condições estéreis não são necessárias, a menos que os recipientes sejam usados para fins de cultura de células. Prepare soluções de vasos de isolamento: B1, adicione 1,5 mL de HEPES 1M a 150 mL de HBSS; B2, adicione 3,6 g de Dextrano a 20 mL de B1; B3, adicione 1 g de BSA a 100 mL de B1.
- Prepare um béquer de 150 ml com 20 ml de B1. Mantenha no gelo e cubra com parafilme para evitar a contaminação do ar.
- Anestesie profundamente o camundongo sob um capuz com uma pequena toalha de papel embebida em 1 mL de isoflurano puro que é adicionado à gaiola. A anestesia é verificada pela falta de reação a um beliscão do dedo do pé. Mate o camundongo por luxação cervical.
nota: Essas etapas são realizadas em conformidade com os regulamentos nacionais e institucionais.
- Opcional: Realize perfusão intracardíaca com 20 mL de PBS 1x para eliminar o conteúdo sanguíneo.
- Corte a pele com um bisturi do pescoço ao nariz e puxe-a para longe. Remova todos os pêlos contaminantes com PBS 1x.
- Para abrir o crânio, primeiro, insira a tesoura anteriormente ao bulbo olfatório e abra a tesoura para romper o crânio em duas partes.
- Remova cuidadosamente o cérebro usando uma espátula cerebral. Dissecar o plexo coróide dos ventrículos laterais, pois eles contaminariam a preparação dos vasos sanguíneos.
nota: Opcional: A preparação final conterá vasos parenquimatosos e meninges. Se não for desejado, as meninges podem ser removidas.
- Transfira o cérebro para o copo contendo a solução de B1 no gelo. Até 8 cérebros podem ser tratados juntos.
2. Homogeneização do tecido cerebral
- Usando dois bisturis, bata manual e vigorosamente o cérebro na solução B1, obtendo posteriormente pequenos pedaços de cerca de 2 mm.
- Homogeneizar a preparação com um homogeneizador Dounce automatizado, realizando 20 golpes a 400 rpm. Certifique-se de que o tubo de vidro seja mantido em gelo e que a parte superior do douncer esteja em solução ao se mover para cima e para baixo, de modo a evitar a formação de bolsas de ar. Se várias amostras forem preparadas, lave o douncer com água ionizada entre cada homogeneização.
3. Purificação do Vaso
- Transferir o homogeneizado para um tubo de plástico de 50 ml e proceder à centrifugação a 2.000 x g durante 10 min a 4 °C. Uma grande interface branca (principalmente mielina) se formará na parte superior do sedimento do vaso (vermelho se nenhuma perfusão for realizada).
- Descarte o sobrenadante. O pellet do vaso e a interface branca permanecerão presos. Adicione 20 mL de solução B2 gelada e agite o tubo manualmente e vigorosamente por 1 min.
- Proceder à segunda centrifugação a 4.400 x g durante 15 min a 4 °C. A mielina agora formará uma camada branca densa na superfície do sobrenadante.
- Separe cuidadosamente a camada de mielina das paredes do tubo, segurando o tubo e girando-o lentamente para permitir que o sobrenadante passe pelas paredes. Descarte a mielina com o sobrenadante. O pellet contendo os vasos permanece preso no fundo do tubo.
- Seque a parede interna do tubo com um papel absorvente enrolado em uma pipeta de plástico de 5 mL e remova todos os fluidos residuais, evite tocar no pellet do recipiente. Mantenha o tubo de cabeça para baixo em um papel absorvente para drenar o líquido restante.
- Suspenda o pellet em 1 mL de solução B3 gelada pipetando para cima e para baixo com pontas de baixa ligação, mantendo o tubo no gelo e, em seguida, adicione mais 5 mL de solução B3. Certifique-se de que os recipientes estejam dispersos o máximo possível e não formem agregados.
4. Filtração
- Prepare um copo com gelo com 30 ml de solução gelada de B3. Cubra com parafilme para evitar contaminação do ar.
- Colocar um filtro de malha de 20 μm num porta-filtro modificado na parte superior de um balão de becker e equilibrar aplicando 10 ml de solução gelada de B3.
- Despeje a preparação do recipiente no filtro e lave os recipientes com 40 mL de solução B3 gelada.
- Retirar o filtro com uma pinça limpa e mergulhá-lo imediatamente no copo que contém a solução B3. Retire os recipientes do filtro agitando-o suavemente.
- Despeje o conteúdo do béquer em um tubo plástico de 50 mL e centrifugue a 2.000 x g por 5 min a 4 ° C.
nota: Alternativamente, a suspensão dos vasos cerebrais da etapa 3.6 pode ser filtrada em um filtro de malha de 100 μm. Neste caso, os vasos maiores são preferencialmente retidos no filtro, enquanto o fluxo contém microvasos (principalmente capilares), que são então filtrados em um filtro de malha de 20 μm, como acima.
- Ressuspenda o pellet de microvasos em 1 mL de solução B3 gelada e transfira-o pipetando-o para um tubo Eppendorf de 1,5 mL. Centrifugue a 2.000 x g por 5 min a 4 °C.