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Ensaio de fagocitose in vitro: um método baseado em imagens ao vivo para estudar a faragocitose sinaptossomal mediada por astrócitos em tempo real

8 de julho de 2025

Neste artigo

Resumo

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Fonte: Byun, Y. G., Chung, W. S. Um novo ensaio de imagem ao vivo in vitro de fagocitose mediada por astrócitos usando sinaptossomos conjugados com indicadores de pH. J. Vis. (2018)

Neste vídeo, avaliamos a capacidade fagocítica de astrócitos purificados in vitro por ensaio de imagem ao vivo. O ensaio serve como uma plataforma de triagem eficaz para identificar compostos químicos que podem aumentar ou inibir a capacidade fagocítica dos astrócitos.

Protocolo

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1. Ensaio de imagem ao vivo de fagocitose (Figura 1)

  1. Prepare uma placa de 24 poços (ou qualquer placa / prato preparado para imagens ao vivo) na qual os astrócitos sejam confluentes (geralmente, 7 a 10 dias de incubação após a purificação é ideal para estabilizar as células).
  2. Remova o meio em cada poço e lave os poços com 1 mL de solução salina tampão fosfato de Dulbecco (DPBS), três vezes. Para minimizar a exposição ao ar, lave os poços rapidamente.
  3. Adicione 300 μL de meio básico de astrócitos imunopanados (IP-ABM) com 5 μL de sinaptossomos conjugados com indicadores de pH e fatores adicionais, como meios condicionados de astrócitos imunopanados (IP-ACM) que podem modular a fagocitose de células gliais.
  4. Incubar a placa em uma incubadora de CO2 por 40 min. Esta etapa permite que os sinaptossomos conjugados com indicador de pH se depositem no fundo das placas.
  5. Remova o meio com sinaptossomos conjugados com indicador de pH não ligado e lave cada poço com 1 mL de DPBS, três vezes.
    cuidado: Não lave com aspereza. Para minimizar a exposição ao ar, lave os poços rapidamente.
  6. Adicione 500 μL de IP-ABM com fatores adicionais para testar nos poços.
  7. Leve a placa para um instrumento de imagem ao vivo e selecione as posições. Ajuste o foco, o tempo de exposição, o brilho e a potência do LED.
    nota: As configurações de tempo de exposição, brilho e potência do LED são variáveis dependendo da intensidade da fluorescência e do objetivo do experimento. No ensaio de imagem ao vivo com sinaptossomos conjugados com indicadores de pH, geralmente definimos esses valores da seguinte forma: exposição: ~ 150–200 ms, brilho: 15 e potência do LED: 4–6.
  8. Defina o formato da imagem, o intervalo de tempo e o número total de ciclos para imagens ao vivo. Defina o intervalo de tempo para 1 ou 2 h, dependendo de quantas posições são selecionadas. Intervalos de 2 horas são recomendados quando mais de 150 posições são selecionadas para imagens ao vivo.
  9. Inicie os experimentos de imagem ao vivo.

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Resultados

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Figura 1. Esquema do ensaio de imagem ao vivo de fagocitose.

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Divulgações

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Não há conflitos de interesse declarados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
vermelho de pHrodo, éster succinimidílico Sondas Molecula Pág. 36600Para conjugação do indicador de pH
Soro fetal bovino (FBS) Gibco16000-044
DMEMGibco11960-044
dPBSWelgene LB001-02
Ensaio de imagem ao vivo de fagocitose
Estágio de Juli NanoEntek
Plug-ins do Time Series Analyzer V3 https://imagej.nih.gov/ij/plugins/ time-series.html

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