Eletroporação ex vivo de fatias cerebelares de embriões de galinha: um método para introduzir DNA de plasmídeo que codifica proteína fluorescente verde para visualizar o desenvolvimento de células granulares

Resumo

Fonte: Hanzel, M. et al.Cultura ex vivo de fatias cerebelares de pintinhos e eletroporação espacialmente direcionada de precursores de células granulares.J. Vis. Exp. (2015)

Neste vídeo, realizamos eletroporação de fatias de cerebelo de embrião de galinha com plasmídeos do gene repórter. A técnica facilita a visualização do desenvolvimento e migração de precursores de células granulares para formar uma camada granular.

Protocolo

1. Eletroporação de Fatias

1. Construa uma câmara de eletroporação fixando o ânodo de um eletroporador na base de uma placa de Petri de 60 mm com fita isolante. Adicione aproximadamente 1 mL de HBSS para cobrir o eletrodo.
2. Coloque um inserto de cultura de 0,4 μm no topo do eletrodo coberto com HBSS. Deixe o inserto de cultura descansar no eletrodo, certificando-se de que sempre haja contato entre o inserto e o eletrodo.
   nota: Nesta configuração, o inserto de cultura com as fatias repousará sobre a superfície da solução, mantendo o circuito, mas permitindo o direcionamento espacial do cátodo.
3. Transfira as fatias identificadas (até cinco por inserto de cultura) para o inserto de cultura usando 3 mL de pipeta Pasteur com a ponta cortada. Separe e deixe assentar na cultura, insira em uma orientação sagital.
4. Usando uma pipeta, remova o excesso de HBSS para que as fatias não sejam mais banhadas em solução.
5. Usando uma ponta de pipeta P10, pipete o DNA (a uma concentração de 1 μg/μL) diluído com 20% de verde rápido sobre a superfície da região alvo de uma fatia. 20% de verde rápido garante uma solução de DNA viscosa e evita a dispersão proibitivamente ampla do DNA. Adicione aproximadamente 5 μL de DNA / solução verde rápida a cada fatia ( Figura 1B ).
6. Coloque o cátodo sobre o tecido alvo desejado e eletropore com pulsos de 3 x 10 V, 10 ms de duração. Evite o contato direto do cátodo com o tecido. Em vez disso, aproveite a tensão superficial do líquido para manter a condutância (coloque o cátodo o mais próximo possível do tecido sem realmente tocar no tecido).
7. Repita a entrega de DNA e eletroporação para várias regiões de EGL em cada fatia cerebelar individual, conforme desejado.
8. Após a conclusão da eletroporação, transfira o inserto de cultura para uma placa de Petri de 30 mm.
9. Para cada cultura, adicione 1 mL de meio de cultura pré-aquecido (Basal Medium Eagle, 0,5% (p / v) D- (+) -glicose, suplemento de B27 a 1%, 2 mM de L-glutamina, 100 U / mL de penicilina, 100 μg / mL de estreptomicina) sob o inserto de cultura, de modo que o inserto de cultura fique em contato com o meio, mas as fatias não sejam banhadas nele.
10. Incubar culturas a 37 °C/6% CO₂ por até 3 dias. Substitua todo o meio de cultura a cada 24 horas por meio fresco pré-aquecido.
11. Após a cultura, fixe as fatias nas inserções de cultura por 1 hora em paraformaldeído a 4% (ou O/N a 4 °C) em um prato fresco de 30 mm sem meio de cultura.

Resultados

Figura 1. A câmara de eletroporação configurada. (A) Uma foto da câmara de eletroporação feita sob medida. A câmara consiste em um ânodo de um eletroporador colocado com segurança na base de uma placa de Petri de 60 mm. O prato contém aproximadamente 1 mL de HBSS para cobrir o eletrodo. O inserto de cultura deve repousar sobre o eletrodo com contato constante entre o...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Águia média basal (Gibco)	Tecnologias da Vida	Rolamento 41010-026
L-glutamina	sigma	G7513
Penicilina/estreptomicina	sigma	Pág. 4333
Inserto de cultura de 0,4 μm	Millipore	PICM0RG50
Eletroporador TSS20 Ovodyne	Intracel	01-916-02	Use pulsos de 3 x 10 V 10 ms para eletroporação.