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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Dissecção do cerebelo e preparação de seções (tempo prático ≈ 15–20 min por animal)
- Coloque uma das placas de cultura de células de 60 mm contendo o meio de dissecção gelado sob o microscópio binocular e remova a placa superior.
- Limpe o pelo da cabeça com etanol 70% (evitando cuidadosamente tocar nos olhos do animal) e decapite o animal com tesouras grandes e afiadas, de acordo com o procedimento aprovado.
NOTA: As fatias cerebelares são geradas a partir de camundongos P9-P10 sem qualquer viés específico de sexo ou cepa.
- Use uma tesoura pequena para cortar a pele ao longo da linha média da cabeça, começando no pescoço e subindo até o focinho do rato.
- Para segurar a cabeça e expor o crânio, dobre a pele ventralmente sob a cabeça e aperte as duas dobras de pele entre os dedos.
- Insira a tesoura pequena suavemente no forame magno e corte o crânio fazendo uma incisão lateral para o lado e, em seguida, corte ao redor do crânio da cabeça. Mantenha a ponta da tesoura o mais paralela e próxima possível do crânio durante o corte, para evitar danos ao tecido cerebral.
- Recupere a parte dorsal do crânio usando uma pinça fina e reta. Enquanto levanta cuidadosamente a parte dorsal do crânio, corte as meninges aderentes (membrana irrigada translúcida que envolve o tecido cerebral), se necessário, com uma tesoura pequena para evitar danificar o tecido cerebral.
- Introduza cuidadosamente uma pinça reta (ou, alternativamente, use uma espátula) entre o crânio ventral e o cérebro, vire suavemente o cérebro e corte os nervos óptico e trigêmeo com uma tesoura pequena.
- Ajude o cérebro a cair por gravidade na placa de cultura de células de 60 mm contendo meio de dissecção gelada, virando a cabeça de cabeça para baixo logo acima da placa e liberando as últimas aderências com uma tesoura pequena, se necessário.
- Usando uma pinça fina, oriente o cérebro com o lado dorsal voltado para o pesquisador e o lado ventral deitado no fundo do prato.
- Sob o microscópio binocular, use a pinça fina e reta para imobilizar o cérebro no lado do prosencéfalo e evite tocar no rombencéfalo, pois ele pode ser danificado. Separe o rombencéfalo do resto do cérebro (prosencéfalo e mesencéfalo, veja o esquema na Figura 1Aa), usando uma pinça fina e reta. Para separar o cerebelo do resto do rombencéfalo, use a pinça fina para cortar os pedúnculos cerebelares sob o cerebelo (veja o esquema na Figura 1Aa').
- Uma vez isolado o cerebelo, arranque cuidadosamente as meninges usando uma pinça fina e reta (veja o esquema na Figura 1Aa').
- Segure o cerebelo suavemente com a pinça curva fina e coloque-o com o lado dorsal para cima na plataforma de plástico perpendicularmente à lâmina de barbear do picador (veja o esquema na Figura 1Bb).
- Aspire qualquer excesso de meio de dissecção ao redor do cerebelo usando uma ponta de pipeta estéril de ponta fina adaptada em uma pipeta de 1 mL (ver esquema na Figura 1Bb).
- Certifique-se de que o cerebelo fique plano, mas não esticado, uma vez colocado na plataforma para obter cortes sagitais ideais durante o corte (consulte o esquema na Figura 1Bb).
- Corte seções sagitais de 300 μm de espessura do cerebelo com o picador de tecidos (veja o esquema na Figura 1Bb '). A força e a velocidade da lâmina devem ser otimizadas no local.
- Adicione delicadamente uma gota de meio de dissecção no cerebelo fatiado. Usando uma ponta de pipeta de calibre largo colocada em uma pipeta de 1 mL, aspire lentamente o cerebelo fatiado e transfira-o de volta para a placa de cultura de células de 60 mm contendo meio de dissecção gelado (veja o esquema na Figura 1Bb'').
- Limpe a plataforma de plástico do picador de tecidos com 100% de etanol entre cada corte de cerebelo. Deixe o etanol evaporar antes de colocar o próximo cerebelo na plataforma.
- Use duas pinças retas finas (ou, alternativamente, agulhas de titânio) para separar fatias individuais e selecione 6–8 fatias do vermis (veja o esquema na Figura 1Cc e 1Cc').
- Pegue uma placa de 6 poços com inserções de cultura e transfira até 4 fatias selecionadas para uma inserção de cultura junto com algum meio de dissecação, usando uma ponta de pipeta de furo largo adaptada em uma pipeta de 1 mL (veja o esquema na Figura 1Cc').
- Coloque as fatias no meio do inserto de cultura usando o meio de dissecção ou pinça para empurrá-las e puxá-las suavemente para o local correto, evitando que entrem em contato umas com as outras (veja o esquema na Figura 1Cc').
- Remova qualquer excesso de meio de dissecção ao redor das fatias usando uma ponta de pipeta de ponta fina. Certifique-se de que as fatias fiquem planas na membrana (veja o esquema na Figura 1Cc').
- Coloque a placa de 6 poços na incubadora imediatamente após adicionar as fatias na membrana.
