Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação da cultura de fatias
- Prepare culturas de fatias de hipocampo organotípicas de camundongos usando camundongos pós-natais de 6 a 7 dias de idade de ambos os sexos.
- Prepare meios de dissecção para cultura de fatias organotípicas consistindo em (em mM): 238 sacarose, 2,5 KCl, 1 CaCl2, 4 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 e 11 glicose em água deionizada e, em seguida, gase com 5% CO2/95% O2 a um pH de 7,4.
- Prepare meios de cultura de fatias organotípicas consistindo em: 78,8% (v / v) de Águia Média Essencial Mínima, 20% (v / v) de soro de cavalo, 17,9 mM de NaHCO3, 26,6 mM de glicose, 2 M CaCl2, 2 M MgSO4, 30 mM de HEPES, insulina (1 μg / mL) e 0,06 mM de ácido ascórbico, pH ajustado para 7,3. Ajuste a osmolaridade para 310–330 osmol usando um osmômetro.
- Dissecar o hipocampo de todo o cérebro usando duas espátulas e fatiar (400 μm) usando um picador de tecido. Separe as fatias usando duas pinças e transfira para insertos de cultura de células de 30 mm em uma placa de 6 poços preenchida com meio de cultura (950 μL) embaixo dos insertos.
- Armazene as culturas de fatias organotípicas em uma incubadora de cultura de tecidos (35 ° C, 5% CO2) e troque o meio de cultura a cada dois dias.
2. Preparação de plasmídeo
- Preparar o plasmídeo para o gene de interesse.
- Subclone aprimorado gene de proteína fluorescente verde (EGFP) em um vetor pCAB.
- Purifique o plasmídeo pCAG-EGFP com um kit de purificação livre de endotoxinas e dissolva em uma solução interna que consiste em água tratada com dietilpirocarbonato contendo 140 mM de K-metanossulfonato, 0,2 mM de EGTA, 2 mM de MgCl2 e 10 mM de HEPES, ajustado para pH 7,3 com KOH (concentração de plasmídeo: 0,1 μg/μL).
3. Preparação da pipeta de vidro
- Puxe pipetas de vidro borossilicato (4,5–8 MΩ) em um extrator de micropipeta (Figura 1A).
nota: As pipetas de vidro usadas para gravações de grampos de contato de células inteiras são ideais para eletroporação.
- Asse pipetas de vidro durante a noite a 200 ° C para esterilizar.
- Verifique o tamanho da ponta da pipeta em um microscópio de dissecção para aproximar a resistência elétrica.
- Opcional: Verifique a resistência da pipeta conectando a pipeta ao eletrodo de eletroporação e use o micromanipulador para manobrar a ponta da pipeta no líquido cefalorraquidiano artificial esterilizado por filtro (aCSF) contendo (em mM): 119 NaCl, 2,5 KCl, 0,5 CaCl2, 5 MgCl2, 26 NaHCO3, 1 NaH2PO4 e 11 glicose em água deionizada, gaseificada com 5% de CO2/95% O2a um pH de 7,4. Confirme a resistência real usando a leitura no eletroporador.
nota: Quanto mais afiada a ponta da pipeta, maior a resistência elétrica. A resistência da pipeta deve ser inferior a 10 MΩ. Pipetas de vidro com alta resistência à pipeta (Figura 1B) geralmente entopem na ponta durante a eletroporação repetida.
4. Configuração do equipamento de eletroporação
- Instale o eletroporador em um equipamento de eletrofisiologia de célula inteira padrão, equipado com um microscópio vertical montado em uma mesa móvel com um micromanipulador e bomba peristáltica.
- Instale o headstage do eletroporador em um micromanipulador e conecte um par de alto-falantes ao eletroporador. Conecte o eletroporador a um pedal que pode ser usado para enviar um pulso quando estiver pronto.
nota: Os alto-falantes emitem um tom quando ligados, que é um indicador da resistência elétrica no eletrodo. Isso torna possível determinar mudanças relativas na resistência sem desviar a atenção do procedimento.
5. Preparação de eletroporação
- Transfira as inserções de cultura de fatias de placas de 6 poços para placas de Petri de 3 cm carregadas com 900 μL de meios de cultura e armazene em uma incubadora de CO2 de mesa até que esteja pronto para realizar a eletroporação.
- Pré-incubar inserções de cultura fresca com meio de cultura de fatias (1 mL) por pelo menos 30 min em uma placa de Petri de 3,5 cm para cultivar fatias após eletroporação.
- Limpe e prepare o equipamento para eletroporação.
- Perfunda as linhas com alvejante a 10% por 5 min para esterilizar o tubo e a câmara antes de iniciar o experimento do dia.
- Perfunda as linhas com água autoclavada deionizada por pelo menos 30 min para enxaguar completamente.
- Perfundir as linhas com aCSF esterilizado por filtro contendo 0,001 mM de tetrodotoxina (TTX).
nota: O TTX minimiza a toxicidade celular e a morte devido à superexcitação dos interneurônios.
- Defina os parâmetros de pulso do eletroporador: amplitude de –5 V, pulso quadrado, trem de 500 ms, frequência de 50 Hz e largura de pulso de 500 μs.
- Encha a pipeta de vidro com 5 μL de solução interna contendo plasmídeo.
- Remova quaisquer bolhas de ar presas na ponta da pipeta sacudindo e batendo suavemente na ponta várias vezes.
- Verifique se a ponteira está danificada visualizando-a em um microscópio de dissecção ou repetindo a etapa 3.3.1 para verificar a resistência da pipeta.
nota: Se a ponta estiver danificada, a pipeta de vidro deve ser descartada, e esta etapa deve ser repetida com uma nova pipeta de vidro previamente preparada na etapa 3.
- Prenda firmemente a ponta da pipeta ao eletrodo e ligue os alto-falantes. Registre a leitura (a resistência da pipeta) do eletroporador quando a ponta entrar em contato com o meio aCSF.
- Corte a membrana da inserção de cultura usando uma lâmina afiada e isole uma cultura de fatia. Transfira cuidadosamente a cultura de fatias para a câmara de eletroporação usando pinças de ângulo agudo e fixe sua posição com uma âncora de fatia.
- Não mantenha a cultura de fatias fora da incubadora por mais de 30 minutos de cada vez para evitar efeitos colaterais, como alterações na saúde ou função neuronal.
6. Células eletroporadas de interesse
- Aplique pressão positiva na pipeta com a boca ou usando uma seringa de 1 mL (pressão de 0,2 a 0,5 mL) conectada ao tubo.
- Use os controles de botão tridimensionais do micromanipulador para manobrar a ponta da pipeta perto da superfície da cultura de fatias.
- Escolha uma célula-alvo e aproxime-se dela, mantendo a pressão positiva aplicada até que uma covinha se forme na superfície da célula, visível no microscópio.
- Execute ciclos de pressão.
- Aplique rapidamente uma leve pressão negativa por via oral para que se forme uma vedação solta entre a ponta da pipeta e a membrana plasmática, indicada visualmente pela membrana subindo um pouco para a ponta da pipeta. Observe um aumento (~ 2,5x a resistência inicial) na resistência da pipeta ouvindo um aumento no tom proveniente dos alto-falantes. Reaplique rapidamente a pressão positiva para que a covinha se forme novamente.
- Complete imediatamente pelo menos mais dois ciclos de pressão sem pausar, depois mantenha a pressão negativa por 1 s.
nota: Pausar entre os ciclos, aplicar muita pressão ou manter a pressão negativa por muito tempo pode causar danos celulares significativos e possivelmente fazer com que a célula morra durante a eletroporação.
- Pulse rapidamente o eletroporador uma vez usando o pedal quando o tom dos alto-falantes atingir um ápice estável no tom, indicando o pico de resistência elétrica. Não espere no pico de resistência por mais de 1 s antes de enviar o pulso.
nota: Não observamos eletroporação fora do alvo ao usar este protocolo. Apenas as células em contato com a pipeta de vidro durante os ciclos de pressão foram transfectadas. Posicionar a pipeta perto de outros neurônios não resulta em transfecção de genes.
- Retraia suavemente a pipeta a aproximadamente 100 μm da célula sem aplicar pressão.
- Reaplique a pressão positiva, verificando se a resistência é semelhante à leitura registrada na etapa 5.5 e, em seguida, aproxime-se da próxima célula.
- Remova possíveis obstruções, indicadas visualmente ou por uma resistência da pipeta significativamente aumentada (>15% maior) após a eletroporação, aplicando pressão positiva.
nota: Se não houver entupimento visível e a resistência ainda for significativamente maior, descarte a pipeta e use uma nova. Em média, uma pipeta pode ser usada para até 20 eventos de eletroporação se o usuário for cuidadoso.
Após a eletroporação, transfira a cultura em fatias para um inserto de cultura fresco e incube a 35 ° C na incubadora por até 3 dias.
