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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Colheita da medula espinhal
NOTA: Todos os instrumentos devem ser autoclavados (135 °C e 30 psi por ciclos de 4 x 7 min) para esterilidade.
- Eutanasiar filhotes de camundongos C57BL/6 de 1 a 3 dias de idade em uma câmara com isoflurano. Aguarde 30 s após a cessação do movimento e aperte a perna para confirmar a falta de resposta.
- Separe a cabeça do corpo usando uma tesoura, com o filhote em decúbito ventral.
- Estabilize as patas traseiras ou cauda e braços na mesa de procedimentos, com o lado dorsal voltado para o usuário.
- Corte a pele usando uma tesoura de íris curva.
- Corte a medula espinhal da região lombar logo acima dos quadris e corte os dois lados do tórax para separá-lo do corpo.
nota: Isso requer a dissecção cuidadosa da medula espinhal dos órgãos viscerais para evitar danos inadvertidos a outros órgãos (Figura 1a).
- Lave sequencialmente por 10 s em placas de Petri de 3 x 10 cm contendo 5 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) esterilizada por filtro de 0,2 μm para remover o excesso de tecido.
- Insira uma agulha 22G e uma seringa cheia de 5 mL de PBS esterilizado por filtro na extremidade caudal da coluna vertebral e lave cranialmente, permitindo que o cordão saia para uma quarta placa de Petri (Figura 1b).
- Colete a medula espinhal em um tubo de 15 mL com 5 mL de HABG (Tabela 1) no gelo. Tenha cuidado para evitar esmagar a medula espinhal.
- Repita as etapas 1.1 a 1.8 para cada filhote da ninhada.
nota: Idealmente, esse processo deve levar menos de 30 minutos por medula espinhal para garantir o isolamento saudável dos neurônios.
2. Isolando neurônios
NOTA: A etapa a seguir deve ser executada em uma capela de fluxo laminar. Espera-se familiaridade com a técnica básica estéril.
- Fatiamento de tecidos
- Pegue o tubo que contém a medula espinhal e agite levemente para suspender o tecido.
- Despeje o tecido do tubo em uma placa de Petri de vidro de 60 mm e corte com uma lâmina de barbear para criar peças finas de ~ 0,5 mm de tamanho.
- Transfira o tecido com uma pipeta de calibre largo para um tubo de 15 ml contendo 5 ml de HABG.
- Coloque-o em banho-maria a 30 °C por 30 min para permitir que as células se equilibrem a essa temperatura. Mantenha as células em um agitador apenas o suficiente para permitir que elas sejam suspensas no fluido.
nota: Esta etapa é feita para evitar o choque das células após a transferência do gelo para o meio de digestão. Manter as células a 30 °C ajuda a diminuir a morte celular associada a um metabolismo aumentado a 37 °C.
- Prepare o meio de digestão (Tabela 1).
- Preparar o gradiente de densidade (Tabela 1).
- Prepare cada uma das 4 camadas em 4 tubos separados de 15 mL, conforme descrito na Tabela 1.
- Adicione 1 mL de cada camada em um novo tubo de 15 mL. Comece com a camada 1 na parte inferior e adicione sequencialmente até atingir a camada 4 na parte superior. Evite perturbar as camadas ao adicionar.
- Lave as placas revestidas com PDL. Lave com água estéril por alguns minutos antes de remover a água restante e deixar secar por 1 h.
- Transfira o tecido para o meio de digestão.
- Retirar o tubo que contém lenços de papel do banho-maria agitador a 30 °C e deixá-lo repousar durante alguns minutos.
- Retirar o tubo do meio de digestão do banho-maria a 37 °C e aspirá-lo para uma seringa com trava de leur.
- Aspire o excesso de HABG do tubo contendo tecido.
- Use um filtro de 0,2 μm na seringa para adicionar meio de digestão ao tubo que contém tecido.
- Colocar o tubo em banho-maria a 30 °C durante 30 min. Manter as células a tremer apenas o suficiente para permitir que fiquem suspensas no fluido.
nota: É importante não manter as células no meio de digestão por muito tempo ou deixar a temperatura ficar muito alta, o que pode levar a uma digestão excessiva e resultar na suspensão do tecido em uma mistura gelatinosa.
- Durante este período, cubra a laminina.
- Realize a trituração (ou seja, separando as células do tecido).
- Retirar o tubo do banho-maria a 30 °C e deixá-lo repousar durante alguns minutos.
- Aspire o excesso de meio de digestão.
- Suspenda o tecido em 2 mL de HABG.
- Usando uma pipeta de diâmetro estreito, triturar 10x para 45 s.
nota: Esta é provavelmente a etapa mais crucial e pode diminuir significativamente o rendimento se não for feita corretamente.
- Aspire o tecido para a pipeta e esvazie imediatamente o conteúdo de volta.
- Evite introduzir ar, pois diminuirá significativamente o rendimento viável.
nota: A pipeta ideal é uma pipeta de vidro de 9". A ponta da pipeta deve ser polida com fogo para suavizar superfícies ásperas. Em seguida, deve ser siliconizado por colocação em uma solução 1:20 de diclorodimetilsilano (DMDCS) em clorofórmio e O/N esquerdo. A pipeta deve então ser removida e deixada secar ao ar. Posteriormente, deve ser autoclavado para esterilização.
cuidado: DMDCS e clorofórmio são altamente inflamáveis e a siliconização deve ser realizada em uma capela de exaustão.
- Aspire os 2 mL superiores de sobrenadante e coloque-os em um novo tubo de 15 mL rotulado como "coleção".
- Repita as etapas 2.7.3–2.7.5 mais duas vezes (o tubo de coleta de células deve ter 6 mL até o final).
- Transfira lentamente o conteúdo do tubo de coleta para o tubo de gradiente preparado na etapa 2.2, evitando a interrupção do gradiente.
- Neste ponto, retire o meio neurobasal previamente preparado (Tabela 1) da geladeira e deixe-o aquecer em um banho a 37 °C.
- Purifique os neurônios.
- Centrifugue o tubo gradiente por 15 min a 800 x g e 22 °C.
- Recolha a(s) camada(s) desejada(s) com uma pipeta (Figura 2) e coloque em um novo tubo de 15 mL. Para o isolamento de neurônios de maior pureza (ou seja, >90%), colete a camada 3. Para obter mais rendimento com menos pureza (ou seja, >70–80%), colete as camadas 2 e 3.
- Diluir o gradiente de densidade adicionando 5 mL de HABG às camadas recém-coletadas.
- Centrifugue a 200 x g durante 2 min a 22 °C.
- Descarte o sobrenadante, ressuspenda em 5 mL de HABG e sacuda o pellet para suspender as células.
- Centrifugue a 200 x g durante 2 min a 22 °C.
- Descarte o sobrenadante, ressuspenda em 3 mL de meio neurobasal e sacuda o pellet para ressuspender as células.
| mídia | armazenamento | Ingredientes | preparação |
| HABG | 4 °C/24h | | 100 mL | - Descongele B27 em geladeira a 4 °C O/N
- Esterilização por filtro (0,22 μm) |
| Hibernar A | 97,8 mL |
| B27 [2%] | 2 mL |
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,25 mL |
| Mídia neurobasal | 4 °C/1 semana | | 100 mL | - Descongele B27 em geladeira a 4 °C O/N
- Esterilização por filtro (0,22 μm)
- Alíquota de porções de 50 mL em tubos de 50 mL (armazenar a 4 ° C) |
| Neurobasal A | 97 mL |
| B27 [2%] | 2 mL |
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,25 mL |
| Caneta/estreptococos [1%] | 1 mL |
| Meios de digestão | Dia de isolamento | | 10 mL | - Agite vigorosamente
- Deixe descansar em banho a 37 ° C por 30 min (idealmente preparado 30 min antes do uso)
- Esterilização por filtro (0,22 μm) |
| HA-Ca | 10 mL |
| papaína | 25 mg |
| GlutaMAX [0,5 mM] | 0,025 mL |
| Gradiente de densidade | Dia de isolamento | | 1 Gradiente | |
| Camada | OptiPrep | HABG |
| (0,13 mL) | (5,29 mL) |
| 1 Parte inferior | 0,26 mL | 1,24 mL |
| algarismo | 0,19 mL | 1,31 mL |
| 3 | 0,15 mL | 1,35 mL |
| 4 Topo | 0,11 mL | 1,39 mL |
Tabela 1: Preparação dos meios e soluções utilizados neste protocolo.
