Descelularização do Complexo Cardiopulmonar: Uma Técnica para Descelularização de Coração e Pulmões a partir de Modelo Murino

Resumo

Fonte: Mayorca-Guiliani, A. E. et al. Descelularização do Complexo Cardiopulmonar Murino. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo demonstra um método de produção de matriz extracelular descelularizada ou andaimes ECM aplicando perfusão anterógrada de detergentes através da vasculatura. Os scaffolds estruturais da ECM podem então ser usados para analisar a remodelação da ECM associada à doença cardiopulmonar.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Microcirurgia post-mortem

1. Eutanasiar o camundongo usando uma câmara de CO₂.
   1. Coloque o mouse em uma câmara de 4 L e comece a encher com 100% de CO₂, começando em 0,2 L / min por 2 min, aumentando até atingir um fluxo de 0,8 L / min após 3 min. O mouse deve ficar inconsciente durante os primeiros 2 min e, em seguida, a respiração deve cessar (geralmente em torno de 5 min, mas o fluxo pode ser mantido conforme necessário). Confirme a morte antes de prosseguir para a próxima etapa.
2. Raspe o tórax, o abdômen e as costas do mouse com o aparador de cabelo e desinfete com etanol a 70%. O barbear reduz muito o número de artefatos devido à presença de pêlos em amostras para imagem ou análise bioquímica.
3. Prenda o mouse em uma bandeja de poliestireno, estendendo seus membros anteriores e posteriores, bem como sua cabeça e cauda. Coloque-o sob o microscópio de microcirurgia.
4. Usando uma tesoura de padrão reto Mayo, estabeleça o acesso cirúrgico com uma incisão cutânea que vai da região submandibular até a parte inferior do abdome e disseque subcutaneamente para expor a parede torácica e o peritônio.
5. Usando uma tesoura microcirúrgica, corte os músculos peitoral maior e peitoral menor ao longo do sexto espaço intercostal em ambos os lados da parede torácica.
6. Usando uma tesoura de padrão reto, corte o esterno ao longo das incisões anteriores e, em seguida, complete uma esternotomia cortando o esterno ao longo de seu eixo longo, depois eleve e prenda os dois lados da parede torácica para expor o complexo cardiopulmonar.
7. Usando micropinças de ponta redonda (ou micropinças Dumont), excise o timo e o tecido adiposo circundante, puxando-os delicadamente de seus anexos. Isso revelará os principais navios.
8. Usando o cautério, cauterize a veia cava descendente e, usando uma tesoura reta, corte o esôfago.
9. Usando micropinças afiadas, separe as veias braquiocefálicas e as artérias braquiocefálicas, carótidas comuns esquerdas e subclávias esquerdas do tecido subjacente para facilitar a ligadura e a cauterização.
10. Usando porta-microagulhas, micropinças afiadas e sutura 9-0 colocam pontos acima da emergência das artérias braquiocefálica, carótida comum esquerda e subclávia esquerda.
11. Cauterize as veias braquiocefálicas.
12. Separe as glândulas salivares submandibulares ao longo da linha média para expor os músculos do pescoço e a traqueia. Separe os músculos para expor o ligamento cricotireóideo. Usando uma microtesoura, abra uma entrada seccionando o ligamento.
13. Introduza um cateter 27 G na traqueia e empurre delicadamente até que a traqueia se ramifique nos brônquios (ou seja, até que a resistência ao cateter seja encontrada, então recue 3 mm). Tenha cuidado para não perturbar os brônquios. Usando uma sutura 6-0, coloque 3 pontos ao redor da traqueia para prender o cateter.
14. Corte o camundongo na altura da 12ª vértebra torácica. A aorta descendente corre anteriormente à coluna vertebral e deve ser seccionada aqui junto com a coluna. Separe a metade inferior.
15. Cateterize a aorta retrógrada e empurre o cateter até atingir o arco aórtico. Usando sutura 9-0, coloque 4 pontos ao redor da aorta, começando 5 mm abaixo da ponta do cateter.

2. Descelularização

1. Conecte o mouse a um sistema de bomba usando tubos de silicone e conectores Luer. Perfundir com água deionizada a 200 μL/min durante 15 min. Mantenha essa taxa de fluxo durante a descelularização.
2. Troque o agente de perfusão para desoxicolato de sódio a 0,5% (DOC) diluído em água deionizada e perfunda durante a noite.
3. Troque o agente de perfusão para dodecil sulfato de sódio (SDS) a 0,1% diluído em água deionizada e perfunda por 8 horas.
4. Perfunda com água deionizada durante a noite para lavar SDS e DOC por 24 h.
5. Ressece o coração e os pulmões descelularizados seccionando suas inserções ao tórax usando uma tesoura curva e armazene em um tubo criogênico estéril com água deionizada com penicilina-estreptomicina a 1% (v/v) e 0,3 μM de azida sódica a 4 °C. Os andaimes da ECM podem ser armazenados por pelo menos 12 semanas. Se o andaime for usado para análise bioquímica (por exemplo, espectrometria de massa), congele em nitrogênio líquido.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microcirurgia
Sutura 6-0, agulha de seção triangular (Vicryl)	Ética	6301124
Microssutura 9-0 (Safil)	B Braun	G1048611
Pinça Adson	Ferramentas de Belas Ciências	11006-12
Pinça Adson com dentes	Ferramentas de Belas Ciências	11027-12
Porta-microagulhas Castroviejo	Ferramentas de Belas Ciências	12061-01
Câmara de ventilação de CO2 para eutanásia de camundongos
Água deionizada (Milli-Q IQ 7000, sistema de água de laboratório ultrapuro)	Merck	ZIQ7000T0
Bandeja de poliestireno descartável (~30 × 50 cm)
Microscópio de dissecção (Greenough, com pescoço de ganso de dois braços)	Leica	S6 D
Microespátula de ponta dupla	Ferramentas de Belas Ciências	10091-12
Micropinça Dumont (duas)	Ferramentas de Belas Ciências	11252-20
Micropinça Dumont com pontas de 45°	Ferramentas de Belas Ciências	11251-35
Máquinas de cortar cabelo	Oster	Rolamento 76998-320-051
Porta-agulhas Halsey (com garras de carboneto de tungstênio)	Ferramentas de Belas Ciências	12500-12
Cateter intravenoso de calibre 24 (Insyte)	Bd	381512
Cateter intravenoso de calibre 26 (Terumo)	Surflo-W	SR+DM2619WX
Tesoura de maionese (corte duro, reto)	Ferramentas de Belas Ciências	14110-15
Microfórceps com pontas aneladas	Aesculap	FM571R
Tesoura de micro-mola (Vannas, curva)	Ferramentas de Belas Ciências	15001-08
Agulhas (calibre 27; Microlance)	Bd	21018
Toalha de papel (estéril) ou guardanapo cirúrgico
Tesoura serrilhada (CeramaCut, reta)	Ferramentas de Belas Ciências	14958-09
Espátula (Freer-Yasargil)	Aesculap	OL166R
Seringas (1 mL; Plastipak)	Bd	3021001
Seringas (10 mL; Plastipak)	Bd	3021110
Tesoura de tendão (Walton)	Ferramentas de Belas Ciências	14077-09
DESCELULARIZAÇÃO
70% Etanol (álcool absoluto 99,9%); o álcool absoluto deve ser ajustado para 70% (vol/vol) usando água deionizada	ameixa	1680766
Água deionizada (Milli-Q IQ 7000, sistema de água de laboratório ultrapuro)	Merck	ZIQ7000T0
Conexões macho Luer-to-tubing (1/8 de polegada)	Instrumentos de precisão mundiais	13158-100
Conexões macho Luer-to-tubing (1/8 de polegada)	Instrumentos de precisão mundiais	13158-100
PBS (pH 7,4, 10×, Gibco)	Thermo Fisher Científico	70011044
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140122
Bomba peristáltica (com 12 canais)	Ole Dich	110AC(R)20G75
Tubo de silicone (com 2 mm de diâmetro interno e 4 mm de diâmetro externo)	Ole Dich	Rolamento 31399
Azida de sódio	Sigma-Aldrich	08591-1ML-F
Desoxicolato de sódio (DOC)	Sigma-Aldrich	D6750-100G