Isolamento do epitélio das papilas circunvaladas (CVP) do modelo de camundongo: um procedimento enzimático para separar o epitélio da CVP da língua do camundongo

Neste artigo

Resumo

Fonte: Shechtman, L. A. et al. Geração e Cultura de Organoides Linguais Derivados de Células-Tronco Gustativas de Camundongos Adultos. J. Vis. Exp. (2021)

Neste vídeo, descrevemos o isolamento do epitélio das papilas circunvaladas (CVP) de uma língua murina.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Isolamento do epitélio CVP

Eutanasiar os camundongos com asfixia por CO₂ de acordo com os regulamentos da IACUC, seguido por um método secundário aprovado, como toracotomia bilateral, luxação cervical, decapitação ou exsanguinação.
Use uma tesoura de dissecação grande e estéril para cortar as bochechas e quebrar a mandíbula. Levante a língua e corte o frênulo lingual para separar a língua do assoalho da cavidade oral. Corte a língua e colete-a em solução salina estéril e gelada tamponada com fosfato de Dulbecco (dPBS) com Ca²⁺ e Mg²⁺.
Remova e descarte a língua anterior cortando logo anterior da eminência intermolar com uma lâmina de barbear (Figura 1A, linha tracejada). Use um lenço delicado para remover qualquer cabelo e excesso de líquido da parte posterior da língua.
Encha a seringa de 1 mL com 200–300 μL de solução enzimática injetável (concentração final: 2 mg/mL de colagenase tipo I e 5 mg/mL de Dispase II em Ca²⁺/Mg²⁺-contendo dPBS, diluído a partir de soluções estoques de 10 mg/mL) e insira uma agulha de 30 G x 1/2 logo acima da eminência intermolar (Figura 1B, seta preta) até um pouco anterior à PVC (Figura 1B, caixa preta). Injete a solução enzimática por baixo e nas bordas laterais do CVP entre o epitélio e os tecidos subjacentes (lâmina própria, músculo). Retire a seringa lenta e continuamente da língua enquanto a injeção é realizada.
Incube a língua em estilo estéril Ca^{2 +} / Mg²⁺ dPBS livre em temperatura ambiente por precisamente 33 min.
Faça pequenos cortes no epitélio bilateralmente e logo anterior à PVC usando uma tesoura de dissecção extra fina e descasque suavemente o epitélio levantando-o com uma pinça fina. Uma vez que o epitélio da trincheira esteja livre do tecido conjuntivo subjacente, coloque-o em um tubo de microcentrífuga vazio de 2 mL pré-revestido com FBS. Faça o corte epitelial antes ou depois de descolar o epitélio da PVC (Figura 1C, D).

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Resultados

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Figura 1: Língua dissecada e epitélio de PVC descascado. (A) A língua é dissecada e a língua anterior é removida cortando-se logo anterior à eminência intermolar (linha tracejada), deixando a língua posterior, que inclui a PVC (caixa preta) (B) Uma agulha é inserida logo anterior à eminência intermolar (seta preta) e a mistura enzimática é injetada ab...