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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação de microbolhas
- Preparação de microbolhas para injeção
nota: O assistente executa esta etapa quando a 'Injeção de Microbolhas (MB) em Embriões' é iniciada. Cada embrião é injetado uma vez, com o tipo de microbolhas escolhido para cada injeção a ser selecionado aleatoriamente pelo assistente, de modo que todos os tipos de microbolhas sejam distribuídos uniformemente ao longo do procedimento, mas administrados em ordem aleatória. Certifique-se de que o cirurgião esteja cego para o tipo de bolha que está sendo injetada.
- Determinar o volume de solução de bolha de reserva necessário para produzir uma concentração final de 1 x 10,8 MB/ml num volume de 400 μL (calcular o volume utilizando as concentrações de reserva). Alíquota do volume correspondente de solução salina para um tubo de microcentrífuga vazio.
- Agite suavemente o frasco de microbolhas selecionado e retire um volume excessivo (~ 50 μL maior que o calculado acima) da solução para uma seringa de 1 mL usando a agulha de 21 G. Injete as microbolhas em um tubo de microcentrífuga vazio.
- Pipetar o volume necessário de solução-mãe de microbolhas e adicionar à alíquota de soro fisiológico. Misture mexendo delicadamente com a ponta da pipeta.
- Aspire a solução diluída de microbolhas para uma seringa limpa usando a agulha de 21 G. Removendo a agulha, elimine quaisquer bolhas de ar da seringa e conecte o luer e o tubo. Empurre lentamente a solução até o final da tubulação, certificando-se de não gerar bolhas de ar.
- Insira a seringa em uma bomba de infusão de seringa ajustada para dispensar as microbolhas a uma taxa de 20 μL / min para um volume total de 20 μL. Conecte uma agulha de vidro puxada na extremidade do tubo. Aproxime a bomba do estágio de injeção.
2. Injeção de microbolhas em embriões
- Selecione e remova aleatoriamente (com colher perfurada) um embrião do prato de mídia refrigerado. Coloque em placa de dissecção localizada no estágio de ultrassom sob o estereoscópio e remova o saco vitelino e as membranas amnióticas com a pinça fina, cortando/rasgando do lado que parece menos vascularizado (o lado antimesometrial). Isso é mais facilmente conseguido perfurando uma área adjacente à região da cabeça.
- Corte o suficiente para remover o embrião de dentro, mas não mais. Estabilize as placas de dissecação usando pequenos pedaços de plasticina.
- Manobre suavemente o saco ao redor do embrião. Posicione o embrião de lado, com a placenta e os vasos umbilicais na frente. Usando os alfinetes de insetos, prenda o saco vitelino (recomenda-se 4 alfinetes) e as bordas da placenta conforme necessário para fixar no lugar. Evite grandes embarcações.
- Lave o embrião com PBS pré-aquecido a 45 ° C até que o embrião reviva. Identifique a veia umbilical e sua rede vascular associada. Posicione o prato de forma que a injeção possa ser feita confortavelmente.
nota: Uma vez aquecido, o sangue no embrião começará a fluir, bombeando visivelmente na artéria umbilical. Quando o fluxo começa, as veias ficam vermelhas brilhantes, com o sangue em ambos os vasos parecendo rapidamente idêntico. Os ramos que surgem da veia umbilical geralmente se sobrepõem aos da artéria umbilical na superfície placentária.
- Depois que o embrião reviver, cubra-o (mas não a placenta) com gel de US pré-aquecido, certificando-se de remover delicadamente quaisquer bolhas de ar (usando a pinça fina) ao redor do embrião. Complete o prato com PBS pré-aquecido.
nota: Fique de olho no nível de solução nas seringas PBS e gel e adicione seringas de backup ao copo de aquecimento conforme necessário.
- Monte a agulha de vidro em uma grande bola de plasticina na borda do prato de dissecação e insira a extremidade da agulha no PBS. Escolhendo uma veia na superfície coriônica do disco placentário, o mais longe possível do ramo principal, apare a ponta no tamanho certo com uma tesoura. A injeção é mais fácil se a ponta for cortada em um pequeno ângulo. Remova todas as bordas irregulares do vidro usando a borda da tesoura de mola.
- Usando a bomba de seringa, injete lentamente a solução de microbolhas a 20 μL / min na agulha de vidro até que todo o ar seja expelido da ponta da agulha e as microbolhas possam fluir livremente para o PBS. Pare a bomba e reinicie para um volume de injeção de 20 μL. Não permita que o ar entre no sistema vascular do embrião durante a injeção.
- Insira a ponta da agulha de vidro suavemente em uma das veias da placenta e certifique-se de que ela esteja imóvel. Afaste a cabeça do estereoscópio e posicione o transdutor acima do embrião. Inicie a imagem.