Isolamento de bactérias comensais conjuntivais à base de swab: uma técnica para isolar bactérias comensais da conjuntiva do modelo murino

Resumo

Fonte: Smith-Page, K. et al. Isolamento e identificação comensal conjuntival em camundongos. J. Vis. Exp. (2021)

Este vídeo descreve uma técnica baseada em swab para isolar bactérias comensais viáveis da conjuntiva ocular. A técnica pode ser usada para traçar o perfil do microbioma bacteriano comensal da conjuntiva, que desempenha um papel defensivo contra patógenos.

Protocolo

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.

1. Preparação de esfregaço, configuração de campo de trabalho, esfregaço de olho de camundongo e enriquecimento de amostra

1. Prepare cotonetes estéreis
   nota: Os cotonetes estéreis são palitos de madeira finamente revestidos com uma fina camada de fibra de algodão e feitos em casa.
   1. Autoclave a quantidade apropriada de rebatidas de algodão e palitos de dente para o número de ratos a serem esfregados.
   2. Retire um pedaço de algodão de meio centímetro de comprimento com o polegar e o indicador. Provoque as rebatidas puxando as bordas com os polegares e indicadores para formar uma única camada porosa plana, parando pouco antes de a rebatida se desfazer (pequenos pedaços de algodão dispersos por toda a rebatida esticada são aceitáveis).
   3. Gire a rebatida em torno de uma das pontas afiadas do palito, segurando levemente a peça esticada na ponta do palito enquanto ela é torcida, veja a Figura 1. O cotonete ocular "concluído" terá uma camada muito fina de algodão esticada sobre a ponta, estendendo-se aproximadamente de meio a um centímetro de distância da ponta.
   4. Insira os cotonetes "concluídos" em um béquer pequeno, com o lado do cotonete voltado para baixo e cubra. Autoclave.
2. Configurar o espaço de trabalho
   1. Prepare anestesia contendo 2 mL de cetamina (100 mg / mL), 400 μL de xilazina (100 mg / mL) e 27,6 mL de solução salina estéril (NaCl 0,9% em dH₂O) em um tubo de centrífuga estéril de 50 mL. Filtre, esterilize e alíquota anestésica para uso imediato (pode ser armazenado a 4 ° C por 1 mês; sempre deixe equilibrar a temperatura ambiente antes de usar).
   2. Limpe e limpe a área de trabalho com desinfetante para minimizar a contaminação.
   3. Alíquota de 0,5 mL de meio estéril de infusão cérebro-coração (BHI) em tubos de microcentrífuga estéreis de 1,5 mL marcados (1 tubo por camundongo e controle); disponha em rack de microcentrífuga. Coloque o rack no gelo.
   4. Configure o fluxo de trabalho da seguinte forma (da esquerda para a direita): estação de anestesia de camundongos (gaiola contendo camundongos experimentais, gaiola estéril vazia, anestesia em temperatura ambiente, agulha de 25 G e seringa de 1 mL), estação de esfregaço ocular (BHI aliquotado em gelo, cotonetes oculares esterilizados, toalhas de papel limpas, spray de isopropanol a 70%) e estação de revestimento (placas de ágar sangue à temperatura ambiente, pipeta de 10 μL, Ponteiras descartáveis estéreis de 10 μL, recipiente para resíduos de risco biológico).
3. Cotonete ocular
   1. Administrar 10 μL de anestesia por 1 g de dose de cetamina e xilazina no peso do camundongo, respectivamente, por via intraperitoneal a cada camundongo adulto e colocá-los em uma gaiola autoclavada. Teste a anestesia apertando a almofada do retropé; nenhum movimento indica anestesia apropriada.
   2. Designe uma mão para manusear apenas camundongos anestesiados e a outra mão para manusear apenas o cotonete e a cultura. Para esfregar, remova o mouse totalmente anestesiado da gaiola; Coloque em cima da superfície de trabalho limpa posicionada de lado com o olho esquerdo exposto. Pulverize as mãos enluvadas com isopropanol, seque com uma toalha de papel limpa.
   3. Destampe o tubo de microcentrífuga BHI especificamente rotulado com a mão dedicada ao manuseio de mídia. Coloque o tubo de volta no suporte da microcentrífuga no gelo. Mergulhe a ponta revestida de algodão do cotonete em BHI, retire o cotonete do tubo girando a ponta 2 vezes contra o tubo interno para remover o excesso de líquido.
   4. Com a mão de manuseio do mouse, segure suavemente o mouse pela nuca. Com a outra mão, coloque a ponta do cotonete contra a região conjuntival medial do olho esquerdo, veja a Figura 2A. Pressione levemente o globo ocular e mova o cotonete em um movimento de lavagem da janela (Figura 2B) para frente e para trás, entre a pálpebra inferior e o olho, 10 vezes. Mantenha pressão constante.
   5. Sem tocar no pelo, remova suavemente a ponta do cotonete, perpendicular ao local onde foi inserido, e coloque o cotonete com o lado do algodão voltado para baixo diretamente em um tubo de microcentrífuga rotulado contendo meio BHI. Aplique um colírio lubrificante no olho esfregado.
   6. Retorne o mouse para a gaiola.
   7. Deixe o cotonete repousar por 10 a 15 min no gelo e remova o cotonete ocular com a mão enluvada esterilizada, misturando a ponta na mídia por 10 rotações. Retire o cotonete girando a ponta contra a parede interna do tubo da microcentrífuga por 5 rotações. Descarte o cotonete em um recipiente de risco biológico.
   8. Repita as etapas 1.3.2 a 1.3.7 para cada camundongo e para amostras de controle (swab de pele ou pele). Esterilize as luvas adequadamente entre cada cotonete.
4. enriquecimento
   1. Enriqueça a amostra incubando o tubo estaticamente durante 1 h a 37 °C
   2. Durante a incubação, rotule uma Tripticase de Soja à temperatura ambiente com 5% de placa de ágar sangue de ovelha (placa TSA) por camundongo e divida ao meio.
   3. Após a incubação da cultura de esfregaço ocular, remova as amostras enriquecidas da incubadora e coloque-as no gelo.
   4. Resumidamente, amostras de vórtice para misturar e chapear de acordo com o esquema na Figura 3A. Alíquota de 10 μL da amostra na placa TSA e incline a placa para formar uma tira, repita 2 vezes.
   5. Do outro lado da linha divisória da placa, pontilhar 10 μL de amostra em ágar, repetir 9 vezes.
   6. Incubar as placas a 37 °C durante 18 h, 2 dias e 4 dias (numa câmara limpa que impeça a secagem das placas de ágar). Conte as colônias em tiras, observe a morfologia e calcule as unidades formadoras de colônias (UFCs) por swab para isolados morfologicamente semelhantes. Olhe para os pontos em busca de organismos únicos não capturados em tiras.

Resultados

Figura 1: Cotonete ocular interno.
(A) Um pedaço fino de algodão puxado de aproximadamente 1 cm foi mantido entre a ponta do palito estéril e o dedo indicador e o palito foi enrolado mantendo uma leve pressão contra o dedo indicador até que o algodão estivesse completamente enrolado na ponta do palito. (B) Exemplo de um cotonete ocular.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Ponta pipetada de 0,1 a 10 μl	EUA Científico	1110-300	Autoclave antes de usar
Pipeta Eppendorf de 0,5 a 10 μl	Fisher Científico	13-690-026
Seringa de 1 ml	Fisher Científico	BD309623	1 seringa para cada grupo de cotonetes oculares
Tubos Eppendorf de 1,5 ml	EUA Científico	1615-5500	Autoclave antes de usar
Ponta de pipeta de 1000 μ ml	EUA Científico	1111-2021	Autoclave antes de usar
200 a 1000 μl de pipetman Gilson (P1000)	Fisher Científico	F123602G
Agulha de 25 G	Fisher Científico	14-826AA	1 agulha por grupo de swab ocular
Peróxido de hidrogênio a 3 %	Fisher Científico	S25359
Incubadora 37 ° C	Equipamento de laboratório
70 % de isopropanol	Fisher Científico	PX1840-4
Injeção de Ana-Sed (xilazina 100 mg / ml)	Santa Cruz Saúde Animal	SC-362949Rx
bico de Bunsen	Equipamento de laboratório
Toalhas de papel limpas	Equipamento de laboratório
Rebatidas de algodão / algodão laminado estéril	CVS
Cetamina (100 mg/ml)	Henry Schein	9950001
mouses	Laboratórios Jackson	C57/BL6J
Placas de Petri	Fisher Científico	08-757-12	Para placas de ágar Manitol Sal
Meio de infusão cérebro-coração RPI	Fisher Científico	Rolamento 50-488525	Prepare de acordo com as instruções e autoclave
SteriFlip (sulfona de poliéster de tamanho de poro de 0,22 μm)	EMD/Millipore, Fisher Scientifc	SCGP00525	Para esterilizar anestesia
Gaiola de rato estéril	Equipamento de laboratório
Palitos de dente (bambu redondo)	Essenciais de cozinha		Autoclave antes do uso e preparação do swab
Ágar Tripticase Soja II com 5% de Placas de Sangue de Ovelha	Fisher Científico	4321261	Conservar a 4 °C até estar pronto a utilizar
Colírio descartável	Farmácia CVS		Colírio Lubrificante Soothe da Bausch and Lomb, 28 frascos, 0,02 fl oz. cada