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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Protocolo EHS
- Na noite anterior ao protocolo EHS, coloque o mouse na câmara ambiental em temperatura ambiente (~ 25 ° C, ≈30% de umidade relativa) para se aclimatar à câmara.
- Use um sistema de aquisição de dados para coletar a temperatura central contínua (Tc), em média em intervalos de 30 s durante a noite.
- Na manhã do protocolo EHS, certifique-se de que o mouse esteja em ou abaixo de uma faixa normal de temperatura diurna antes de aumentar a temperatura da câmara (ou seja, 36–37,5 °C). Isso garante que o camundongo não tenha febre e não tenha sofrido estresse indevido durante esse período.
- Quando o camundongo estiver estável e dentro de uma faixa de temperatura central normal de repouso, remova a comida e a água e pese o animal. Feche a porta da câmara e aumente a temperatura da câmara para uma meta de 37.5 °C e 40% –50% de umidade relativa, ou a temperatura e umidade ambiente desejadas. Verifique a temperatura e a umidade da câmara com um monitor de temperatura e umidade calibrado.
- Cerque a câmara com uma cortina black-out para manter a luz e os distúrbios mínimos durante o protocolo. Monitore o mouse continuamente durante o protocolo por meio de câmeras remotas iluminadas por infravermelho. Foque uma segunda câmera no monitor de temperatura e umidade, colocado próximo ao volante. Faça quaisquer ajustes no controlador para o ponto de ajuste da câmara ambiental para garantir leituras precisas de temperatura perto do animal.
- Assim que a câmara atingir sua temperatura desejada medida pela segunda câmera no monitor de temperatura (isso pode levar ~ 30 min), abra rapidamente a porta da câmara e coloque o mouse na roda de corrida forçada.
- Inicie o protocolo de roda de corrida forçada a uma velocidade de 2.5 m/min e aumente a velocidade 0.3 m/min a cada 10 min até que o mouse atinja um Tc de 41 °C. Assim que o mouse atingir essa temperatura central, permita que a velocidade permaneça constante até a limitação dos sintomas, caracterizada por uma aparente perda de consciência, uma queda ou desmaio para trás e a incapacidade de continuar a correr ou segurar o volante. Confirme este ponto de tempo quando o mouse tiver três rotações para trás na roda sem sinais de resposta física. Alternativamente, identifique um endpoint humano seguindo as regras locais da IACUC para determinar quando interromper o protocolo (por exemplo, quando Tc ~ 43 ° C). Este desfecho está ligeiramente acima da limitação dos sintomas em essencialmente todos os camundongos.
- Para executar o protocolo de resfriamento rápido (R), assim que o mouse atingir a limitação dos sintomas, pare a roda e remova-a imediatamente da roda de corrida forçada. Pese o mouse e coloque-o de volta em sua gaiola inicial para se recuperar em temperatura ambiente. Durante esse tempo, deixe a porta da câmara aberta e retorne o ponto de ajuste da incubadora à temperatura ambiente para permitir que a câmara esfrie rapidamente. Este procedimento resulta em >99% de sobrevida a longo prazo.