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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Preparação do mouse
- Anestesiar o mouse
- Prepare pentobarbital sódico (50 mg/kg) em uma seringa.
- Pegue o rato (macho C57BL/6 de 8 semanas) com a mão esquerda de modo que sua barriga fique voltada para cima e sua cabeça fique mais baixa que sua cauda. Desinfete a pele abdominal com álcool 75%.
- Segurando a seringa com a mão direita, perfure a linha branca do abdômen com a agulha ligeiramente para o lado direito da pele em 3–5 mm. Certifique-se de que a agulha da seringa e a pele estejam em um ângulo de 45°, injete o pentobarbital lentamente na cavidade abdominal. Após o barbear, desinfete ao redor do local da incisão do camundongo 3 vezes alternadamente com álcool a 75% e solução de clorexidina.
- Verifique se a anestesia foi bem-sucedida pela falta de reflexo de endireitamento.
- Injete isotiocianato-dextrano de rodamina B na veia caudal.
- Prepare 100 μL de isotiocianato de rodamina B a 10 mg / mL em uma seringa.
- Limpe a cauda do rato com álcool 75%.
- Segure a cauda com a mão esquerda, segure a seringa com a mão direita com a agulha paralela à veia e injete o corante de 100 μL.
- Pare o sangramento com um cotonete após a injeção.
- Mergulhe o pelo abdominal do rato com gaze umedecida com água estéril e raspe o abdômen do rato com uma navalha, fazendo movimentos na direção do pelo. Após o barbear, desinfeta ao redor do local da incisão do camundongo 3 vezes alternadamente com álcool a 75% e solução de clorexidina.
- Depois de limpar uma almofada de aquecimento com álcool 75%, abra a almofada de aquecimento e coloque o mouse de costas na almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 °C.
2. Fixando o fígado do camundongo com o quadro de imagem de órgãos do corpo
NOTA: O quadro comercial de imagens de órgãos ainda não foi lançado.
- Coloque uma ventosa limpa em uma posição fixa.
- Instale um dispositivo de imagem de órgãos (Figura 1) e limpe a almofada de aquecimento e a ventosa com álcool a 75%.
- Conecte a ventosa (5 mm de diâmetro) à mangueira da bomba de vácuo e ligue a bomba de vácuo.
- Em uma mesa estéril esterilizada com álcool 75%, desinfeta ao redor do local da incisão do camundongo 3 vezes alternadamente com álcool 75% e solução de clorexidina, depois desinfeta ao redor do local da incisão do camundongo 3 vezes alternadamente com álcool 75% e solução de clorexidina, em seguida, use uma tesoura cirúrgica para cortar 2 cm de pele da borda esternal inferior do camundongo e expor o fígado.
- Coloque o mouse junto com a almofada de aquecimento na base do suporte.
- Ajuste o acessório de imagem do órgão para que a ventosa segure o fígado. Em seguida, use uma pressão negativa de 30–35 kPa para sucção para que o fígado se prenda à ventosa (Figura 2).
3. Ajustando o microscópio de varredura a laser multifotônico
- Ligue o microscópio multifotônico e selecione a objetiva de 60x/1,00 W.
- Fixe a moldura e o mouse sob a lente objetiva.
- Adicione uma gota de solução salina normal que possa cobrir toda a lente, que é o centro da ventosa, e ajuste a lente objetiva para apenas tocar a solução salina normal.
- Clique duas vezes no ícone do computador para ligar o software do laser e ligar o interruptor. Em seguida, pressione e segure o botão liga/desliga e o obturador por 3 s.
- Defina o comprimento de onda para 800 nm.
- Inicie o software operacional do microscópio usando o computador.
- Para a configuração de aquisição, defina Laser 800.
